Novedoso proceso para la impresión 3D Decellularized Matrices
January 7th, 2019
Este protocolo describe la producción de filamento de policaprolactona (PCL) con microesferas de ácido (PLA) de poliláctico incrustados que contienen matrices decellularized (DM) para la impresión 3D de ingeniería construcciones de tejidos estructurales.
Este método permite la co-impresión de sintéticos estructurales y componentes biológicos para andamios diseñados por tejidos. Estos andamios pueden replicar el entorno del tejido nativo con mayor precisión, lo que puede ser beneficioso para las células cultivadas. La principal ventaja de esta técnica es que puede imprimir estructuras de sonido mecánicamente sin dañar el material biológico encapsulado dentro de los andamios en una técnica todo en uno para la ingeniería de tejidos.
Produzca microesferas con la matriz deseada encapsulada. Estas microesferas se hicieron con cartílago decelularizado a partir de extremidades traseras porcinas. Varían en tamaño.
Trabaje con una máquina de tamiz para obtener microesferas de tamaño uniforme. Asegúrese de que las tres bandejas de tamiz se hayan limpiado y secado a fondo antes de su uso. Ensamble el agitador de tamiz con la bandeja de malla más grande en la parte superior y la bandeja de malla más pequeña en el medio.
Ponga la bandeja de tamiz en la parte inferior. Coloque las microesferas secas en la bandeja superior. A continuación, coloque la tapa en la bandeja.
Tamiz grueso durante ocho a diez minutos. Luego tamiz fino durante ocho a diez minutos. Mientras espera, organice el papel de pesaje para las esferas tamizadas.
Cuando el tamizado esté completo, retire cuidadosamente una bandeja de tamiz. Coloque la bandeja boca abajo en el papel de pesaje. Toque suavemente los lados para asegurarse de que la mayoría de las esferas se caigan.
Con todas las placas de tamiz vaciadas en papel de pesaje, deseche las esferas de gran tamaño y de tamaño inferior. Las esferas restantes tienen el tamaño correcto para su uso en pasos posteriores. Coloque estas esferas en un tubo centrífugo etiquetado.
Almacene el tubo en un congelador Celsius de 20 grados hasta que sea necesario. Pesar el material necesario para hacer el material del filamento. Haga una relación de peso de uno a cuatro de microesferas a polvo de policaprolactona con al menos 25 gramos de microesferas.
Transfiera la mezcla de polvo a un mezclador de laminación en miniatura. Mezclar el polvo a 20 rotaciones por minuto durante cinco minutos. Después de cinco minutos, detenga la rotación y voltee el contenedor.
A continuación, mezcle a 20 rpm durante cinco minutos adicionales. Para continuar, lleve la mezcla a una configuración de extrusora y cola de impresión. Configure el extrusor para que su salida sea de unos 60 centímetros de la entrada de una bobina.
A continuación, en el elemento de calentamiento del extrusor, asegúrese de que no hay chaqueta aislante. Coloque un ventilador de escritorio a medio camino entre el extrusor y la cola para enfriar el extrusión. Coloque otro ventilador cerca de la chaqueta de calefacción para enfriarlo con aire ambiente.
A continuación, asegúrese de que la boquilla adecuada esté unida al extrusor y ajuste la temperatura del elemento calefactor. Encienda los ventiladores de refrigeración y permita que el instrumento alcance un estado estable. Después de 20 a 30 minutos, obtenga la mezcla PCL de microesfera y llene la tolva del extrusor.
Encienda la cola y el sinfín del extrusor para iniciar la extrusión del filamento. Utilice fórceps y tire manualmente del filamento extruido inicial. Alimente el filamento a la bobina de filamentos.
A medida que se extruye, observe el filamento para identificar su composición. Después de algún tiempo, la composición del filamento aparecerá uniforme que se desea. Envuelva la cinta alrededor del filamento para marcar el inicio de la región uniforme.
Más allá de los rodillos de la cola, monitoree el diámetro del filamento. Utilice pinzas para comprobar si el diámetro está cerca de los 1,75 mm deseados. Ajuste las velocidades y temperaturas de la cola de impresión y del extrusor según sea necesario.
Para ajustar el diámetro del filamento, primero altere las velocidades de la cola y del extrusor. También puede cambiar la temperatura del extrusor, aunque esto generalmente no es necesario. Continúe rellenando la tolva y extruyendo hasta que se utilice todo el polvo.
Cuando la tolva esté casi vacía, agregue polvo PCL a la tolva para eliminar la mezcla de microesfera. Supervise la extrusión mientras agrega el polvo PCL. Al principio, las microesferas seguirán siendo visibles en la extruga.
Eventualmente, cuando no haya más microesferas visibles, deje de agregar el PCL. Separe y etiquete el filamento con microesferas en la concentración deseada. Cuando haya un polvo mínimo en la tolva, deje de extruir y apague el equipo.
El filamento se puede utilizar en una impresora de modelado de deposición fusionada estándar. Cargue el filamento en la impresora que esté equipada con boquillas del diámetro deseado. Con el modelo cargado, ajuste la temperatura y la velocidad lineal para la impresión y comience a depositar el filamento.
El filamento personalizado se deposita capa por capa. Preste especial atención a la primera capa y ajuste los ajustes según sea necesario. Estos dos andamios impresos en 3D son difíciles de distinguir a esta escala.
Uno tiene filamento que contiene policapralactona, PCL solamente. El otro tiene filamento PCL con microesferas incrustadas de ácido poliláctico y matrices desceluarizadas. Visto mediante microscopía electrónica de barrido, el andamio solo PCL parece en su mayoría liso.
Por el contrario, para el otro filamento, las microesferas incrustadas en el PCL son visibles en toda la muestra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las microesferas sobre o de menor rendimiento pueden afectar la dinámica de flujo del material en el extrusor. Por esta razón, asegúrese de preparar correctamente sus microesferas antes de usarlas.
Con el fin de minimizar los residuos, es aconsejable crear un gran lote de filamento necesario para todos los experimentos en lugar de crear lotes más pequeños con más frecuencia. La experiencia en la producción de filamentos llegará con el tiempo. Los andamios producidos siguiendo este procedimiento se pueden evaluar in vitro e in vivo para responder preguntas adicionales sobre la mayor inducción y resistencia mecánica en comparación con otros andamios bioimpresos.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la inducción contragénica de la matriz porcina desceluarizada dentro de los andamios 3D. No olvide que trabajar con partículas pequeñas puede presentar riesgos respiratorios. Se recomienda usar una pequeña máscara de partículas durante este procedimiento.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este protocolo describe un método para la co-impresión de sintéticos estructurales y componentes biológicos para crear andamios de tejidos sintéticos. Estos andamios pueden replicar con mayor precisión el entorno de tejido nativo, beneficiando a las células cultivadas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos
- Impresión 3D
- Biomateriales
Antecedentes
- Las matrices descelularizadas (DM) se utilizan para mejorar la funcionalidad del andamio.
- La policaprolactona (PCL) y el ácido poliláctico (PLA) son materiales clave en la producción de andamios.
- Las microesferas pueden encapsular materiales biológicos sin dañarlos.
- Esta técnica permite la integración de propiedades mecánicas y biológicas en los andamios.
Propósito del estudio
- Producir andamios de tejidos sintéticos mecánicamente sólidos.
- Encapsular matrices descelularizadas dentro de microesferas para mejorar el cultivo celular.
- Desarrollar un método que combine componentes estructurales y biológicos en un solo proceso de impresión.
Métodos utilizados
- Producción de filamento de PCL con microesferas de PLA incorporadas.
- Uso de cartílago descelularizado de extremidades posteriores de cerdo.
- Técnicas de impresión 3D para la fabricación de andamios.
- Caracterización del tamaño y las propiedades de las microesferas.
Principales resultados
- Se crearon con éxito andamios que mantienen la integridad estructural.
- Se demostró la capacidad de encapsular materiales biológicos de manera efectiva.
- Se mostraron condiciones mejoradas de cultivo celular dentro de los andamios.
- Se validó el método para producir constructos de tejidos sintéticos complejos.
Conclusiones
- Este método mejora el potencial para crear andamios de tejidos funcionales.
- Las técnicas de co-impresión pueden cerrar la brecha entre materiales sintéticos y biológicos.
- Las aplicaciones futuras pueden incluir medicina regenerativa y reparación de tejidos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Integrating decellularized matrices within 3D-printed scaffolds enables the creation of tissue-engineered constructs that combine mechanical integrity with biologic functionality. This approach addresses a critical challenge in early discovery and preclinical research by preserving bioactivity during fabrication, supporting predictive confidence in tissue modeling. The method positions bioprinting as a platform for developing disease-relevant systems and advancing translational biomaterials research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Supports functional validation of biomaterial cues for progenitor cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving biologic agent activity during scaffold fabrication.
- Improves predictive confidence in tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D scaffolds for downstream cell-based assays.
- Enables quantitative comparison of scaffold surface features and cell responses.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound or biomaterial screening.
- Prepares validated biological systems for reliable evaluation of regenerative cues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold composition with disease-relevant tissue environments for translational studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of tissue repair strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by maintaining biologic function in constructs.
- Facilitates in vitro and in vivo assessment of scaffold performance.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, assay development, and preclinical research by enabling the fabrication of biologically active, mechanically robust 3D scaffolds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-matrix interactions and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative scaffold outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable surface features and composition for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional biomaterial cues for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation in tissue engineering.
- Operational Value: Standardizes scaffold production with reproducible and scalable outputs.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk and supports efficient go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials processing and 3D printing instrumentation.
- Demands analytical infrastructure for scaffold characterization and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation and extrusion parameters.
- Adaptation may be needed for different tissue types or biologic agents.
- Proper handling of particulates and batch scaling are essential for reproducibility and safety.
