Visualización fluorescente de ARN etiquetado con Mango en geles de poliacrilamida a través de un método de postmancha

Aquí presentamos un método de tinción post-gel sensible, rápido y discriminatorio para la imagen de ARN etiquetados con aptámeros de mango de ARN I, II, III o IV, utilizando geles de electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) nativos o desnaturalizantes. Después de ejecutar geles PAGE estándar, el ARN con etiqueta Mango se puede teñir fácilmente con TO1-Biotin y luego analizarse utilizando lectores de fluorescencia comúnmente disponibles.

La metodología de imágenes de gel etiquetada con Mango que se demuestra aquí es robusta y se prevé que sea capaz de extenderse simplemente en términos de sensibilidad y especificidad. Esto simplificaría aún más la purificación rutinaria de arneses y ARN biológicamente importantes mediante la simple conveniencia de añadir una etiqueta de mango al ARN de interés. Los ARN están siendo implicados en más y más enfermedades para este método de datación post es una manera fácil y rápida de ser capaz de rastrear y visualizar el ARN.

Se requerirá un cuidado adicional en la transferencia del gel de un lugar a otro, ya que los geles son frágiles y propensos a romperse. Para preparar un gel desnaturalizar de 30 mililitros, primero seleccione el porcentaje de poliacrilamida con el azul Bromofenol apropiado, y los tintes de cianol de xileno en comparación con un ARN de interés para asegurar la separación de banda alta. A continuación, mezcle las soluciones A, B y C según la tabla uno y agregue APS y timud.

Verter inmediatamente la solución de gel en un aparato de fundición de gel adecuado. Inserte el cono deseado y deje el gel a polimerasa durante aproximadamente 30 minutos. Insonda el depósito de gel con 1 solución XTBE y retire cuidadosamente el cono.

Levante cuidadosamente el gel y úselo en el aparato de gel y asegúrelo con clips de aglutinante. Con una jeringa, aspire los pozos inmediatamente antes de la carga de la muestra. Prepare 1 muestras de ARN mediante la adición de una solución de carga de gel desnaturalable 2X a las muestras de ARN de interés.

Utilice un termociclador para calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, cargue las muestras enfriadas en la parte inferior de cada pozo utilizando puntas de carga de gel. Y así el gel a temperatura ambiente asegurando que la potencia es efectivamente baja para no romper la placa de vidrio del aparato de gel.

Preparar la solución de tinción de gel 1X según el manuscrito en un recipiente de vidrio limpio que sea lo suficientemente ancho como para ajustarse cómodamente al gel. Añadir suficiente solución de tinción de gel 1X al recipiente para que el gel esté completamente cubierto con la solución cuando se coloca en un rotador orbital. Una vez que el gel termine de funcionar, retire el gel del aparato, corte sus 'pozos, y una esquina del gel con el fin de ayudar a determinar la orientación.

A continuación, transfiera cuidadosamente el gel a la solución de tinción de gel 1X. Para realizar la toma de imágenes, decante cuidadosamente la solución de tinción y enjuague el gel rápidamente con agua. Por último, transfiera cuidadosamente el gel a la bandeja que se va a colocar en el imager.

Enrolle una pipeta de vidrio sobre el gel para eliminar las burbujas atrapadas y el exceso de líquido. Y proceder a tomar una imagen de gel. Los aptámeros de mango uno, dos, tres, cuatro se resistieron sustancialmente a la desnaturalización hasta aproximadamente una concentración de urea molar.

El tiempo de tinción de 20 a 40 minutos fue suficiente para la máxima florescencia de gel. El tiempo más largo no era adecuado para los pequeños ARN utilizados en este estudio, ya que comenzaron a difundirse fuera del gel. El análisis del fluorómetro mostró que los aptámeros de Mango uno, dos y tres en presencia de Urea podrían plegarse más rápidamente que el aptámero cuatro.

En ausencia de Urea, el plegado fue mucho más rápido como se esperaba. La sensibilidad del método de tinción posterior fue mostrada por bandas individuales correspondientes a ARN bien plegados para cada una de las variantes de Mango en geles nativos y desnaturalizadores con un poco menos sensibilidad para el posterior. La cuantificación de geles nativos fue lineal de troncos sobre aproximadamente un orden de magnitud con Mango uno, dos y cuatro comportándose de una manera más lineal que Mango tres.

La cuantificación de los geles desnaturalizadores fue más lineal, lo que sugiere que la presencia de urea en el gel desnaturalizadora podría proporcionar una forma más homogénea de plegar los aptámeros una vez que se colocan en la solución de tinción de biotina TO1. Los ARN etiquetados con mango se pueden detectar en presencia de ARN total utilizando tinción de biotina TO1 en comparación con la tinción SG. Recuerde asegurarse de que el recipiente de tinción de gel es lo suficientemente grande como para caber el gel de lo contrario el gel puede plegarse sobre sí mismo.

Las muestras de ARN se transferirán de un lugar a otro. Al igual que los geles desnaturalistas, este método se puede realizar para un gel nativo. Ejecuta el gel en una habitación fría a una potencia más baja para mantener las condiciones nativas.