Tinción de plata fluorescente: una técnica para visualizar la proteína total en geles de poliacrilamida

La tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida emplea sondas fluorogénicas para detectar y cuantificar las proteínas.

Comience con un gel de poliacrilamida con proteínas, separadas en bandas mediante electroforesis. Remoje en una mezcla fijadora de etanol y ácido acético, que evita que las bandas se difundan al desnaturalizar las proteínas.

Lave el gel para eliminar el ácido acético residual y el etanol. Sumerja el gel en tinte de nitrato de plata. Los iones de plata se unen fuertemente a grupos cargados negativamente en las proteínas.

Incubar en la oscuridad. Enjuague el gel en agua ultrapura para eliminar los complejos de iones de plata no unidos.

Sumerja el gel en una solución de desarrollo que contenga una sonda fluorogénica multicomponente: TPE-4TA. Esta sonda aniónica se dirige a los iones de plata unidos a la proteína, formando agregados insolubles que activan las propiedades fluorogénicas de la sonda, impartiendo así fluorescencia.

Como la activación de la fluorescencia depende de la agregación, las sondas no unidas no emiten ninguna señal, lo que permite la tinción total de proteínas con una emisión de fondo reducida.

Incube el gel en la oscuridad con una agitación suave, asegurando un desarrollo fluorogénico completo. Transfiera el gel en un tampón de retención para eliminar las sondas sueltas. Finalmente, obtenga imágenes del gel para obtener la intensidad de la señal de la banda. Grafique la intensidad de la señal de fluorescencia contra la curva de proteína estándar para calcular la cantidad total de proteínas en la muestra.

Después de la electroforesis, sumerja el gel en una solución de 100 mililitros que contenga etanol y ácido acético en un agitador orbital e incube dos veces durante 30 minutos cada una, a temperatura ambiente mientras agita a 50 RPM. A continuación, lave el gel tres veces con agua ultrapura en un recipiente limpio, y cada lavado durará 10 minutos.

Primero, disuelva 0,01 gramos de nitrato de plata en 10 mililitros de agua ultrapura para preparar una solución madre con una concentración del 0,1%. Agregue 100 microlitros de esta solución madre en 100 mililitros de agua ultrapura para hacer que la solución de trabajo de nitrato de plata. En una campana extractora, sumerja el gel en 100 mililitros de la solución de trabajo de nitrato de plata en una cámara de vidrio sellada.

Use papel de aluminio para proteger el gel de la luz durante la impregnación e incube durante 1 hora mientras agita a 50 RPM en un agitador orbital. Después de esto, lave el gel dos veces con agua ultrapura en un recipiente limpio, y cada lavado use aproximadamente 100 mililitros de agua y dure 60 segundos.

Es importante usar agua ultrapura para limpiar el gel después del paso de impregnación de plata para minimizar las manchas de fondo.

Primero, agregue 50 mililitros de agua ultrapura a 3 miligramos de tinte TPE-4TA. Sonicar la solución durante 3 minutos y añadir 5 microlitros de solución de hidróxido de sodio 1 molar entre cada sesión de sonicación, para ayudar a disolver el colorante, normalmente hasta tres veces. Luego, verifique la fluorescencia de la solución bajo una lámpara UV de 365 nanómetros para asegurarse de que el tinte esté completamente disuelto. Solo las soluciones débiles o no emisivas indican una disolución total.

Para preparar la solución de revelado fluorogénico, agregue 10 mililitros de la solución madre de TPE-4TA a 90 mililitros de agua ultrapura. Use un medidor de pH para verificar el pH de la solución. Ajuste la solución a un pH entre 7 y 9, utilizando una solución de hidróxido de sodio diluida o ácido acético, si el pH está fuera de rango.

A continuación, transfiera el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mililitros de la solución de revelado fluorogénico y asegúrese de que el gel esté completamente sumergido. Selle el recipiente y cúbralo para protegerlo de la luz. Agite el recipiente durante la noche en un agitador orbital a 50 RPM y a temperatura ambiente.

Transfiera el gel a un recipiente limpio y destiña en 100 mililitros de etanol al 10% durante 30 minutos. Luego, enjuague el gel en agua ultrapura durante 5 minutos. El gel se puede visualizar en un transiluminador de sobremesa o obtener imágenes en una máquina de documentación de gel en el canal de 365 nanómetros o en el canal de 302 nanómetros.