Name: Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia In Situ La hibridación en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende a detectar y cuantificar moléculas de ARNm individuales en células de levadura mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Este protocolo permite visualizar la localización nuclear y dinámica transcripcional en Saccharomyces cerevisiae con resolución de molécula única.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones GM046406 (de DB) y por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Centro de Biología Cuantitativa (GM071508). RSM reconoce el financiamiento de la Beca de Investigación de Postgrado NSF. MNM con el apoyo de una beca de Lewis-Sigler. Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Botstein útil para los debates y los miembros ex Allegra Petti y Nikolai Slavov por sus contribuciones al proyecto de ciclo metabólico. Damos las gracias a Daniel Zenklusen y Robert Singer para conseguir nosotros empezó con el método de FISH.

Las figuras 1 y 2 son diagramas esquemáticos de los procedimientos experimentales FISH y análisis de imagen de tuberías utilizada para la cuantificación FISH imágenes. 1. Soluciones de prepararse * Las soluciones a continuación son para uso con sondas Singer. Si el uso de sondas de Stellaris, sustitúyase &quot;40% de formamida&quot; por &quot;10% de formamida&quot; tanto en tampón de hibridación y la solución de lavado. Cambios adicionales en tampón de hibridación al utilizar sondas Stellaris son (1) añadir 1 g de sulfato de dextrano y (2) no incluyen 10 mg ssDNA. Tampón B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1 M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Buffer spheroplasting 890 l Tampón B 100 l VRC 10 l 25000 U / ml de liticasa 2 l β-mercaptoetanol &lt;fuerte&gt; tampón de hibridación (10 ml, volumen final) 10 mg E. coli tRNA 10 mg de DNA de cadena simple * 100 l 200 mM de stock VRC 40 l de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (hasta 10 ml de volumen final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampón de Hibridación puede mantenerse en alícuotas de 0,5 ml a -20 ° C para la conveniencia. Tampón de lavado (50 ml, volumen final) 5 ml de SSC 20X 20 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (50 ml de volumen final) Etiquetado Buffer 1,06 g de carbonato sódico 100 ml de agua DEPC pH 9 2. Probe-etiquetado (sondas Singer solamente) Obtenemos estas sondas mediante síntesis en la casa usando un aparato de síntesis de oligonucleótidos ABI. Typicaliado, 4-5 ~ 50 bp oligonucleótidos son sintetizados que son homólogas al gen de interés, sustituyendo timidina amino-alilo durante varios thymidines espaciadas al menos 8, preferiblemente 10 + pb aparte. Debido a su sensibilidad al ozono, se trabaja en una instalación libre de ozono cuando se utilizan colorantes CY. <ol><li> Obtener ~ 5 sondas y resuspender en 100 l de agua - las concentraciones de verificación en Nanodrop. </li><li> Dependiendo del número de sondas / genes, combine total de 10 oligonucleótidos mg / gen (por ejemplo, si se 5 / sondas de genes, entonces quiero 2 mg / sonda). </li><li> Utilice columnas QIAquick para purificar sondas según QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. </li><li> Añadir 10 volúmenes de tampón de PN con el total de volumen de sondas combinadas y mezclar. </li><li> Aplicar la muestra a la columna QIAquick - si el volumen total es mayor que 750 l, girar hacia abajo dos veces utilizando la mitad del volumen en cada giro </li><li> Deje reposar durante 1 min. </li><li> Centrifugar 1 min a 6000 rpm. </li><li> Lavar con 750 l PE Buffer. </li><li> Centrifugar1 min a 6000 rpm. </li><li> Eliminar el flujo a través de la columna y re-giro durante 1 min a 13000 rpm para secar. </li><li> Columna QIAquick Place en tubo nuevo de microcentrífuga y el ADN se eluye con 50 l H 2 O - Asegúrese de H 2 O pH está dentro de 7,0 y 8,5 y se coloca directamente sobre la membrana. </li><li> Deje reposar durante 1 min. </li><li> Centrifugar durante 1 min a 13.000 rpm para eluir el ADN. </li><li> Liofilizar ADN a 45 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 10 l buffer de etiquetado y añadir al tubo de tinte sin tocar el tinte. </li><li> Repita con el otro buffer etiquetado 10 l. </li><li> Vortex y centrifugar tubos de tinte y ADN. </li><li> Cubra los tubos con papel de aluminio y guardar en la oscuridad a RT O / N para etiquetar. </li><li> Repita QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. Realizar con dos diferencias: - Añadir 200 l de tampón PN sondas y poner sondas marcadas a través de columnas de 2x. - Realizar 3 lavados con tampón PE con el fin de eliminar cualquier tinte no unido antes de la elución. </li><li> After elución obtener la concentración a través de nanogota. El etiquetado de eficiencia es típicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de una sola hebra. </li></ol> 3. Coverslip Preparación <ol><li> Coloque los cubreobjetos en los portaobjetos en plasma-acicalarse cámara de vacío ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (cuanto más cerca del centro de la mejor). </li><li> Coloque la cámara de vacío en el microondas y asegúrese de que está sellado. </li><li> Encienda la bomba primero y luego gire en vacío de una sola vez de la bomba se pone en marcha. </li><li> Encienda el horno de microondas, y dejar 5 segundos después plasma es visible. </li><li> Apague la bomba de vacío a continuación. </li><li> Saque la cámara de vacío y retirar cubreobjetos con unas pinzas (aquellos que han caído necesita ser limpiado de nuevo). </li><li> Lugar cubreobjetos lado limpiado en placas de 12 pocillos. </li></ol> 4. Procedimiento Fijación <ol><li> Crecer levadura a un OD 600 de aproximadamente 0,1-0,2 en medio mínimo. 10 ml de células produce suficiente FOr ~ 10 hibridaciones separadas. </li><li> Añada 1/10 del volumen 37% de formaldehído directamente a los medios de cultivo (10 ml de cultivo + 1 ml de formaldehído al 37%) y dejar reposar durante 45 min. </li><li> Lavar 2x con hielo 1 ml de tampón B frío en un tubo de microcentrífuga (puede girar a 13.000 rpm durante 1 min). </li><li> Añadir 1 ml de tampón spheroplasting. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. Compruebe células cada pocos minutos bajo microscopio hasta la mayoría de las células son de color negro (es decir, no la eliminación brillante). </li><li> Lavar 2x con tampón enfriado con hielo B, girando a baja velocidad (~ 3500 rpm). </li><li> Añadir 1 ml de EtOH al 70%, resuspender suavemente y dejar toda la noche a 4 ° C (se puede almacenar indefinidamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedimiento de hibridación <ol><li> Preparar la solución de hibridación: a 100 l de tampón de hibridación, agregue 1-3 l de la sonda, luego vortex y centrifugar. Cantante utilizan sondas 8-10 ng totales por sonda conjunto (es decir, por gen). Hemos fotografiado hasta 3 genes simultáneamente con 3 diferentessonda marcada rente fija. </li></ol> Asegúrese de calentar la solución de hibridación a temperatura ambiente antes de abrirlo. Para sondas Stellaris, se recomienda empezar 4 reacciones de hibridación independientes mediante la adición de 1 l cada uno de 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100 diluciones de trabajo de las sondas para ver cuál es el óptimo. Diluciones de trabajo de sondas Stellaris se preparan en tampón de hibridación. <ol start="2"><li> Se centrifuga (para todos los pasos posteriores; 3.500 rpm, 5 min) las células fijadas (por ejemplo, 200 l) y aspirar lejos del etanol. </li><li> Resuspender suavemente en 1 ml de tampón de lavado que contiene el mismo porcentaje de formamida como el tampón de hibridación. Deje reposar durante 2-5 min. </li><li> Centrifugar la muestra y el tampón de lavado aspirado, a continuación, añadir solución de hibridación. Incubar en la oscuridad con agitación suave, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: El siguiente procedimiento es para la aplicación de células / imagen en cubreobjetos. Para wincineración / células de formación de imágenes en placas de 96 pocillos, incluyendo el oxígeno solución de eliminador de especies reactivas alternativa ver <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Al día siguiente, o antes, limpio (ver procedimiento) y tratar cubreobjetos con 150 l 0,01% de poli-L-lisina durante 5 min. Aspirar, dejar secar, lavar 3 veces con H2O destilada y dejar secar. </li><li> En la mañana, añadir 1 ml de tampón de lavado a la muestra, resuspender suavemente, centrífuga y aspirar, a continuación, volver a suspender en otro 1 ml de tampón de lavado y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar con 2 x SSC + 0,1% de Triton X-100 a TA 15 min en un agitador. </li><li> Tome medio de montaje fuera del congelador para permitir que suba a temperatura ambiente antes de montar. </li><li> Lavar con 1X SSC a TA 15 min en un agitador. </li><li> Diluir DAPI en PBS (0,1 mg / ml final) y volver a suspender las células en 150 l. </li><li> Solución Place a limpiar / poli-lys-treacubre-ted en placa de 12 pocillos, al menos 30 minutos sin ser molestados. </li><li> Retire la solución (es posible colocarlo en una hoja de cubierta de repuesto como copia de seguridad) y se lava 3 veces con 1 ml de 1X PBS. </li><li> Coloque 3 l de prolongar medio de montaje del oro en un portaobjetos (Invitrogen P36934). Para ello, uno a la vez si tiene varias hojas de la cubierta para evitar la desecación del medio de montaje. </li><li> Agregar ~ 0,5 ml de etanol al cubreobjetos en placas de 12 pocillos, retire la hoja de la cubierta y el aire seco, mientras que la celebración de unas pinzas. </li><li> Coloque cubrir deslizamiento celular del lado hacia abajo en medio de montaje y dejar endurecer varias horas o O / N en la oscuridad. </li><li> Selle los bordes con esmalte de uñas y proceder a la creación de imágenes. </li></ol> 6. Obtención de imágenes de células con Olympus IX-81 microscopio invertido general <ol><li> Para la adquisición de imágenes utilizamos software Slidebook (inteligente imaging.com) y un 1,45 NA, aceite objetivo TIRFM 100X. Para GFP serie, DAPI, Cy3, Cy5 y Cy3.5 imagen: conjuntos de filtros Chroma (ver reactivos). </li><li> Utilice el filtro de DAPIpara encontrar y centrarse células. </li><li> Establezca este como punto de referencia. </li><li> Tome un z-stack de imágenes alrededor del punto de referencia donde la distancia total es de 5 m con 0,2 mM tamaño (25 aviones). Repita el procedimiento para cada canal de colorante (es decir, cada sonda conjunto). </li><li> Exportar como TIFF de 16 bits para el análisis de imágenes. </li></ol> 7. Resumen Análisis de Imágenes (sondas Singer) A continuación ofrecemos un resumen de los métodos de cálculo que utilizamos para el análisis de imágenes de peces en MATLAB. Las funciones de MATLAB relevantes utilizadas están entre corchetes a la derecha. Los algoritmos y los umbrales están sintonizados para los datos de las sondas de estilo Singer. Uso de sondas de estilo Stellaris serán necesarios algunos ajustes, en particular a la etapa de filtración final (7,8). Identificación teléfono 15 <ol><li> Separar las células del fondo utilizando un umbral global sobre DAPI imágenes 16 [graythresh]. </li><li> Identificar núcleos mediante la función maxima extendida [imextendedmax]. </li><li> Células segmento utilizando núcleos como semillas para un algoritmo de cuenca [cuenca]. </li></ol> Encuentra puntos de interés en cada canal de fluorescencia <ol start="4"><li> Lleve a cabo la transformación tophat para normalizar fondo y mejorar la relación señal-ruido [bwmorph]. </li><li> Encontrar máximos para identificar la capa de enfoque (en el plano z) para cada punto de [imregionalmax]. </li><li> Filtrar lugares potenciales utilizando un modelo de ajuste lineal a un gradiente radial. </li></ol> Intensidad punto de medición y señales de la sonda mono contra poli filtro <ol start="7"><li> Ajustar un perfil gaussiano 2D al lugar en la capa de enfoque previamente identificados y la intensidad estimación 17. </li><li> Filtrar los puntos débiles utilizando un umbral (basado en histograma). Para sondas tipo Singer esto es importante, pero lo es menos para las sondas de Stellaris. </li><li> Contar puntos en cada celda. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hasta la fecha, pescado ha sido sobre todo un método de bajo rendimiento. El uso de Cy3, Cy3.5, y Cy5 tintes limita el número de genes se puede investigar en células individuales para tres a la vez. Algunas sondas adicionales se han desarrollado (Stellaris), pero el número de sondas distinguibles se encuentra todavía en más de siete. Para evitar esta limitación, las estrategias de etiquetado combinatorias utilizando múltiples fluoróforos se han utilizado para crear códigos de barras para diferentes especies de ARNm 19,20. Más recientemente, Lubeck y Cai utilizan códigos de barras óptico y espectral para cuantificar 32 especies diferentes al mismo tiempo con los pescados en células de levadura individuales 19. Una limitación de este enfoque combinatorio reciente es que requiere el uso de super-resolución de la microscopía. El análisis necesario para distinguir las sondas de código de barras también es bastante complejo. Hemos encontrado que Cy3 y Cy3.5 son preferibles a Cy5 para experimentos de FISH. Una de las limitaciones del tinte Cy5 es su sensibilidada photobleaching. Sin embargo, Stellaris ha desarrollado recientemente Cy5 variantes que se anuncian como más resistentes a photobleaching, y puede aliviar este problema técnico. Es también digno de mención que el pescado es un método costoso de implementar y que tanto Singer y Stellaris sondas suelen costar $ 700 - $ 1,000 por sonda conjunto, aunque los precios de las sondas disponibles en el mercado deberían disminuir en el futuro. Ahorradores de reactivos y etiquetado eficientes trae sondas Singer hasta el rango más bajo en precio. Uno de los principales desafíos técnicos es la separación de los puntos de sonda única o múltiple, que requiere la aplicación de algoritmos de punto a indicar sofisticados. Esto puede tomar una amplia revisión manual para ajustar los parámetros de análisis de imágenes para instalaciones experimentales específicas. Un resumen de nuestra cartera de cálculo con funciones relevantes MATLAB se proporciona en la Sección 7 del protocolo. Este problema es un tanto aliviado por las sondas de Stellaris que sólo tienen<html> una etiqueta por sonda. Por lo tanto, requiere la colocalización de múltiples sondas para ver una señal. Dado que el pescado requiere la fijación de las células, que no facilita el seguimiento de las células individuales en el tiempo. Anteriormente, se utilizaron los datos de instantánea FISH para reconstruir la dinámica de la expresión de genes en las poblaciones de levadura ciclismo metabólicamente individuales 6. Ciclo metabólico se observa en la pre-hambrientos, cultivos continuos, y se caracteriza por oscilaciones colectivas en toda la población en el consumo de oxígeno. Estas oscilaciones se asocian con el genoma de las transcripciones oscilaciones que se producen por medio de todos los genes de levadura en las diferentes fases de consumo de oxígeno. Hemos tratado de determinar si el ciclismo metabólico estaba presente en cultivos de levaduras continuas sin sincronizar. Si está presente, las transcripciones que son anti-correlacionados en las poblaciones síncronos también deben ser anti-correlación en las células individuales no sincronizadas, y viceversa para transcripciones correlacionados. ent &quot;&gt; Para reconstruir dinámica de la producción de ARNm en el tiempo, los datos de la instantánea observados debe ser comparado con lo que se espera de un modelo del comportamiento subyacente. Existen limitaciones teóricas a que tales&quot; instantáneas &quot;de los datos de expresión de genes pueden ser utilizados para determinar la dinámica de expresión de genes subyacentes y que tipo de modelos se pueden distinguir 21. Para los datos de los ciclos metabólicos, en lugar de mostrar directamente la presencia de oscilaciones temporales, las mediciones estadísticas se llevaron a cabo para demostrar que efectivamente existe una celda programa oscilatoria autónoma consistente con mayor microarray mediciones.

Usando técnicas de medición a granel, no es posible ensayar el número de transcripciones o la actividad transcripcional dentro de las células individuales 1. Uso de proteínas fluorescentes conducidos por promotores de interés como reporteros de la expresión génica puede abordar este problema en cierta medida, pero el tiempo necesario para las proteínas fluorescentes para plegar oscurece la dinámica de los primeros. Proteínas fluorescentes de larga vida tampoco pueden reportar vidas ARNm. El método FISH se puede usar para ensayo de ARNm durante su ciclo de vida completo, desde la iniciación de la transcripción en el núcleo para la posterior maduración y la decadencia en las células individuales, con la resolución de una sola molécula. El original en experimentos in situ para la visualización de los ácidos nucleicos utilizados sondas de ARN radiomarcadas para sondear elementos de ADN. Estos incluyen la visualización de ADN ribosomal en los ovarios de la rana Xenopus laevis 2 y el ADN satélite en tejidos de ratón 3. La primera fluorescente in situ en experiment utiliza una molécula de ARN marcado con un fluoróforo a la sonda secuencias particulares de ADN 4. La primera aplicación de sondas fluorescentes para la visualización de ARN in situ era la visualización de la expresión del gen de actina de pollo en cultivo de tejido muscular 5. Más recientemente, en la levadura en ciernes, PEZ, se ha utilizado para investigar oscilaciones en la transcripción durante el ciclo metabólico de levadura 6, la descomposición de ARNm durante la progresión del ciclo celular 7, y la localización espacial de los transcritos de ARNm durante la mitosis 8. PECES se ha utilizado en la levadura para mostrar que las fluctuaciones no correlacionadas en forma constitutiva genes transcritos, que constituyen más de la mitad de todos los genes de la levadura, surgen de iniciación de la transcripción no correlacionado 9. En las especies distintas de la levadura, pescado ha sido utilizado para identificar marcadores de células madre en el intestino del ratón 10 y para determinar que la penetrancia incompleta de destinos celulares puede resultar de genes estocásticos fluctuaciones de expresión en C.Elegans embriones 11. El método descrito aquí PESCADO funciona mediante la hibridación de marcado tinte, sondas de ADN de cadena sencilla a ARNm mensajes. Las células se obtuvieron imágenes y los ARNm se cuentan usando un algoritmo de punto de detección. Sondas de cadena simple pueden ser generados con un sintetizador de ADN y marcaron a continuación (se hace referencia aquí como sondas Singer) o ordenados comercialmente como sondas de pre-marcados (sondas Stellaris) 12,13. Una diferencia importante entre el cantante y Stellaris sondas es que las sondas de Singer son más largas (~ 50 pb) y son multi-etiquetados, mientras que las sondas Stellaris son cortos (~ 20 pb) con sólo una etiqueta por sonda, como se describe por Raj et al 14. Además, el enfoque Stellaris utiliza muchos más sondas de genes que el de Singer (~ 30 frente a 5 sondas por gen, respectivamente). A continuación se proporciona un protocolo que describe el uso de cualquier tipo de sonda. En la sección 2, se proporciona un protocolo para etiquetar amino-alilo sondas timidina que contienen wi-ésimo un colorante Cy elegido. Una visión general de los pasos de cálculo necesarios para identificar los puntos individuales de ARNm se proporciona en la Sección 7.

<table><tbody><tr><td>Complejo de ribonucleósidos de vanadilo</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Liticasa</td><td>Sigma</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Roche</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA (libre de RNasa)</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&#8211; etanol</td><td>Fisher</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, dilactato</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X (sin RNasa)</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Shelton Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Citrato salino-sódico (SSC) 20X</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>Formamida (desionizada)</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>158968</td><td>Para solución GLOX</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>Para solución</td></tr> <tr>GLOX<td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C3155</td><td>para solución GLOX</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina (0.01%)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Warner Instruments</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Montaje Medio</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Eliminación de Nucleótidos QIAGEN</td><td></td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Sondas FISH</td><td>Biosearch Technologies Pedido</td><td></td><td>personalizado para la secuencia de ARNm deseada</td></tr><tr><td>Fondo de vidrio Placas de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>Alternativa a los cubreobjetos</td></tr><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Colorantes Cy3, Cy3.5, Cy5</td> GE <td>Healthcare</td><td></td><td>monofuncional NHS-ester</td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPO</fuerte></td></tr><tr><td>Limpiador Plasma-Preen I</td><td>Terra Universal</td><td>9505-00</td><td>Controlador (Cat #9505-17 opcional)</td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td><td>Para el funcionamiento</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de campo amplio</td> Plasma-Preen <td>Olympus</td><td>IX81</td><td>O objetivo</td></tr><tr><td>equivalente 100X</td> Fuente de luz <td>Olympus</td><td>1-UB617R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>X-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>o juegos de filtros equivalentes</td></tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td><td></td></tr><tr><td>Cooled CCD o EMCCD Cámara</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización y análisis de las moléculas de arnm mediante fluorescencia<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

La hibridación in situ fluorescente (FISH) método permite detectar los ácidos nucleicos en el medio ambiente celular nativo. Aquí se proporciona un protocolo para el uso de FISH para cuantificar el número de ARNm en las células individuales de levadura. Las células pueden ser cultivadas en cualquier condición de interés y después se fijaron y hacen permeables. Posteriormente, múltiples desoxioligonucleótidos monocatenario conjugados con tintes fluorescentes se utilizan para etiquetar y visualizar los ARNm. Fluorescencia de difracción limitada de las moléculas de ARNm individuales se cuantifica usando un algoritmo de punto de detección para identificar y contar el número de ARNm por célula. Mientras que los métodos de cuantificación más estándar de transferencias Northern, RT-PCR y microarrays de expresión génica proporcionan información sobre los ARNm promedio en la población mayor, PEZ, facilita tanto el recuento y localización de estos ARNm en las células individuales a una resolución de una sola molécula.

La Figura 3 muestra histogramas típicos calculados a partir de FISH imágenes y se utiliza para determinar el número de los ARNm presentes en las células individuales. Una ventaja importante de la microscopía basado en la cuantificación del ARN es que se puede obtener información sobre la localización de las transcripciones. Por ejemplo, hemos utilizado FISH para identificar ARNm en células individuales con una inducible CBF1 alelo (Figura 4). Debido a que muchas moléculas de ARNm están presentes en el sitio de la transcripción, que son capaces de identificar la presencia y ubicación de los sitios de transcripción dentro del núcleo. Mediante la utilización de diferentes colorantes para ARNm de etiquetas de diferentes genes, uno puede cuantificar múltiples especies de ARNm en las mismas células. Para demostrar esto, las células de levadura se incubaron en presencia de α-factor de y sorbitol. FUS1 transcripción (Quasar670 colorante, rojo) es inducida por α-factor. Transcripción STL1 (Quasar 570 tinte, verde) es inducido por el aumento de la osmolaridad extracelular ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 es un ejemplo de FISH con las sondas Singer. Figura 5 es un ejemplo de FISH con las sondas de Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema del procedimiento experimental FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de la tubería de análisis de imagen. Los puntos finales se determinan en la figura más a la derecha. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Histograma de las intensidades de terreno para un gen particular, utilizando sondas Singer </strong&gt;. Intensidad de la sonda se computan tanto las células externas (azul) en el interior (rojo) y. Puntos de baja intensidad son o ruido o sondas individuales. Mensajes ARNm reales se etiquetan con múltiples sondas. Al utilizar las sondas Stellaris, sondas individuales son menos detectables y por lo tanto los umbrales y los filtros se deben ajustar en consecuencia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> La Figura 4. Los resultados representativos de procedimiento PESCADO cantante. En este experimento, la transcripción CBF1 se activa con un promotor inducible 18. Los núcleos se tiñen de azul con DAPI. MRNAs CBF1 etiquetados con Cy3-etiquetados sondas. Las flechas blancas destacan la presencia de CBF1 sitios de transcripción en el núcleo. Transcripciones de ARNm individuales son visibles en el citoplasma. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Los resultados representativos de procedimiento PESCADO Stellaris. Células de levadura Mata fueron expuestos simultáneamente a 30 ng / ml de factor de α-y 0,75 M de sorbitol durante 10 min y se probaron simultáneamente para FUS1 (Quasar 670, rojo) y STL1 (Quasar 570, verde) transcripciones. En el cuadro resaltado, podemos ver una célula de responder sólo a la feromona (FUS1 sitio de inicio, rojo) y la otra predominantemente responder al sorbitol (sitio de inicio de STL1, verde).

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el recuento de ARNm en células individuales con una resolución de una sola molécula.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la presencia de moléculas de ARNm con especificidad de molécula individual en células individuales de levadura. Primero, fije las células de levadura y el formaldehído utilizando un tampón que contenga lisasa. Haga permeables las células hasta que la mayoría de las células ya no presenten un brillo fásico intenso.A continuación, incubar las células permeabilizadas con moléculas de ADN monocatenario marcadas con fluorescencia y luego montar las células sobre un cubreobjetos limpiado con plasma. En última instancia, los resultados obtenidos mediante microscopía de fluorescencia pueden detallar la presencia y localización de moléculas de ARNm en células individuales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la expresión génica, microarreglos y transferencias northern, es que los ARNm individuales pueden visualizarse en células aisladas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transcripción. Esto incluye cuantificar el número de ARN de brazo por célula en una población, lo cual puede informar modelos de regulación a nivel del promotor. También puede utilizarse para determinar la localización y las vidas medias de los transcritos durante el ciclo celular.En una cámara de vacío con plasma previo, coloque cubreobjetos sobre las laminillas. Luego coloque la cámara de vacío en un microondas y asegúrese de que esté sellada. Encienda la bomba una vez que la bomba haya comenzado.Encienda ahora el vacío, encienda el microondas y deténgalo cinco segundos después de que el plasma sea visible. Luego apague el vacío, seguido de la bomba. Saque la cámara de vacío.Luego, transfiera las laminillas con la cara limpia hacia arriba a placas de 12 pocillos. Cultive la levadura hasta alcanzar una A 600 de aproximadamente 0.1 a 0.2. En medio mínimo, 10 mililitros de células producen suficiente material para unas 10 hibridaciones.Añada un volumen igual a una décima parte de formaldehído al 37 % directamente al medio de cultivo e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Centrifugue las células a 3000 G durante cinco minutos. Re suspenda el precipitado en un mililitro de tampón B y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.Lave dos veces con un mililitro de tampón B frío en hielo en un tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 13.000 RPM durante un minuto. A continuación, agregue un mililitro de tampón de plaqueo esférico e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos.Monitoree las células microscópicamente cada pocos minutos hasta que la mayoría de las células estén negras. Luego lave dos veces con tampón frío con hielo. B.Girando a baja velocidad de 3 500 RPM.Añada un mililitro de etanol al 70%. Suspender suavemente el precipitado y dejarlo toda la noche a cuatro grados Celsius o almacenarlo indefinidamente a menos 20 grados Celsius. Para preparar la solución de hibridación, añada de uno a tres microlitros de sonda al tampón de hibridación de 100 microlitros.Luego, agite en vórtex y centrifugue. Hemos obtenido imágenes de tres genes diferentes simultáneamente utilizando tres conjuntos diferentes de sondas. Ahora, centrifugue la muestra de levadura fijada y aspire el tampón de lavado.Añada la solución de hibridación e incube en la oscuridad con agitación suave durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Trate los portaobjetos limpios con 150 microlitros de polilisina al 0,01 % durante cinco minutos. Luego aspire y seque al aire.Se lavan las laminillas tres veces con agua destilada y se secan al aire después de un lavado con 1X SSC. Se suspenden las células en 150 microlitros de 0,1 microgramos por mililitro. Se prepara recién un alícuota de la tinción DAPI, se aplica la suspensión celular sobre las cubreobjetos tratados con polilisina y se incuba durante 30 minutos. A continuación, se descongela el medio de montaje ProLong Gold a temperatura ambiente.Coloque tres microlitros sobre un portaobjetos. Luego agregue aproximadamente 0,5 mililitros de etanol a una laminilla. En la placa de 12 pocillos, retire la laminilla y séquela al aire mientras la sostiene con pinzas.Coloque el cubreobjetos con el lado de las células hacia abajo sobre el medio de montaje y deje que endurezca varias horas o durante la noche en la oscuridad. Selle los bordes con esmalte de uñas y continúe con la obtención de imágenes. Tome una serie de imágenes alrededor del punto de referencia, cubriendo una distancia total de cinco micrómetros con un tamaño de paso de 0.2 micrómetros.Repita la adquisición de imágenes para cada canal de colorante correspondiente a cada conjunto de sondas. A continuación, continúe según se detalla en el texto adjunto. Para identificar las células mediante segmentación por transformada de watershed, identifique los puntos utilizando un gradiente radial y mida los puntos mediante un ajuste gaussiano.Normalmente, los histogramas se calculan a partir de imágenes de FISH y se utilizan para determinar el número de ARNm presentes en células individuales. Una ventaja importante de la cuantificación de ARN basada en microscopía es que permite obtener información sobre la localización de los transcritos. Por ejemplo, este FISH utiliza sondas individuales para identificar ARNm en células individuales con un alelo CCB CBF inducible.Dado que muchas moléculas de ARNm se encuentran en el sitio de transcripción, es fácil identificar la presencia y ubicación de los sitios de transcripción dentro del núcleo. La utilización de diferentes colorantes para marcar los ARNm de distintos genes facilita la cuantificación de múltiples especies de ARNm en las mismas células. En este experimento, las células de levadura se incubaron en presencia de factor alfa y sorbitol. Usando sondas FISH con las sondas Stelara, los datos muestran una célula que responde únicamente al feromona, indicado por un sitio de inicio FUS rojo.Simultáneamente, otra célula responde predominantemente al sorbitol, donde el sitio inicial de S TL está marcado en verde. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y visualizar moléculas individuales de ARNm en levaduras una vez dominado. Esta técnica puede realizarse adecuadamente en dos días.Recuerde tener una concentración de células suficientemente densa. Las muestras diluidas requieren que se capturen y almacenen más campos.

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Investigación

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