Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia In Situ La hibridación en Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la presencia de moléculas de ARNm con especificidad de una sola molécula en células de levadura individuales. Primero, fije las células de levadura y el formaldehído usando tampón que contenga liasa. Permeable las células hasta que la mayoría de las células no estén brillantes.

A continuación, incube las células de perme con moléculas de ADN monocatenario marcadas con fluorescencia y luego monte las células en un cubreobjetos limpiado con plasma. En última instancia, los resultados obtenidos por microscopía de fluorescencia pueden detallar la presencia y localización de moléculas de ARNm en células individuales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la expresión génica, los microarrays y los northern blots, es que los ARNm individuales se pueden visualizar en células individuales.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de transcripción. Esto incluye cuantificar el número de ARN de brazo por célula en una población, lo que puede informar modelos de regulación a nivel de promotor. También se puede utilizar para determinar la localización y la vida media de los transcritos durante el ciclo celular.

En una cámara de vacío de preen de plasma, la cubierta se desliza en los portaobjetos. Luego coloque la cámara de vacío en un microondas y asegúrese de que esté sellada. Encienda la bomba una vez que se encienda la bomba.

Encienda la aspiradora, ahora encienda el microondas y deténgase cinco segundos después de que el plasma sea visible. Luego apague la aspiradora, seguida de la bomba. Extraiga la cámara de vacío.

A continuación, transfiera los cubreobjetos con el lado limpio hacia arriba a 12. Las placas de pocillos hacen crecer la levadura hasta un A 600 de alrededor de 0,1 a 0,2. En medios mínimos, 10 milésimas de pulgada de celda producen suficiente para aproximadamente 10 hibridaciones.

Agregue un décimo volumen de formaldehído al 37% directamente al medio de crecimiento e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Centrifugar las células a 3000 Gs durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón B y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.

Lavar dos veces con un mililitro de tampón B helado en un tubo de microcentrífuga. Centrífuga a 13.000 rpm durante un minuto. A continuación, agregue un mililitro de recubrimiento de esfero, tampe e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Monitoree las células microscópicamente cada pocos minutos hasta que la mayoría de las células estén negras. A continuación, lavar dos veces con tampón helado. B. Girando a baja velocidad de 3, 500 RPM.

Añadir un mililitro de etanol resus al 70%. Suspenda el pellet suavemente y colóquelo durante la noche a cuatro grados centígrados o guárdelo indefinidamente a menos 20 grados centígrados. Para preparar la solución de hibridación, agregue de uno a tres microlitros de sonda a 100 microlitros de tampón de hibridación.

Luego vórtice y centrífuga. Hemos obtenido imágenes de tres genes diferentes simultáneamente utilizando tres conjuntos de sondas diferentes. Ahora centrifugar, la muestra de levadura fija y aspirar el tampón de lavado.

Agregue la solución de hibridación e incube en la oscuridad con una suave agitación durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Tratar los labios cubiertos limpios con 150 microlitros de polilisina al 0,01% durante cinco minutos. A continuación, aspire y seque al aire.

Los portaobjetos se lavan tres veces con agua destilada y se secan al aire después de un lavado con un XSSC Resus, suspenden las células en 150 microlitros de 0,1 microgramos por mililitro. Manchar de dappy recién preparado, una alícuota, la suspensión celular sobre la cubierta tratada con polilisina, deslizar e incubar durante 30 minutos. A continuación, descongele el medio de montaje de oro prolongado a temperatura ambiente.

Coloque tres microlitros en un portaobjetos. A continuación, añada unos 0,5 mililitros de etanol a un cubreobjetos. En la placa de 12 pocillos, retire el cubreobjetos y seque al aire mientras lo sostiene con pinzas.

Coloque la cubierta, con el lado de la celda deslizante hacia abajo, sobre el medio de montaje y deje que se endurezca varias horas o toda la noche en la oscuridad. Selle los bordes con esmalte de uñas y proceda a la toma de imágenes. Tome un Zack de imágenes alrededor del punto de referencia donde la distancia total es de cinco micrómetros con un tamaño de 0,2 micrómetros.

Repita la imagen para cada canal de tinte correspondiente a cada juego de sondas. A continuación, proceda como se detalla en el texto adjunto. Para identificar las celdas por segmentación de cuencas hidrográficas, identifique las manchas utilizando un gradiente radial y mida las manchas utilizando un ajuste gaussiano.

Por lo general, los histogramas se calculan a partir de imágenes de peces y se utilizan para determinar el número de ARNm presentes en células individuales. Una ventaja importante de la cuantificación de ARN basada en microscopía es que se puede obtener información sobre la localización de las transcripciones. Por ejemplo, este pez utiliza sondas individuales para identificar ARNm en células individuales con un alelo CCB CBF inducible en un alelo.

Debido a que muchas moléculas de ARNm están presentes en el sitio de transcripción, es fácil identificar la presencia y ubicación de sitios de transcripción dentro del núcleo. La utilización de diferentes tintes para marcar ARNm de diferentes genes facilita la cuantificación de múltiples especies de ARNm en las mismas células. En este experimento, las células de levadura se incubaron en presencia de factor alfa y sorbitol Utilizando peces con las sondas Stelara, los datos muestran que una célula responde solo a la feromona indicada por un FUS rojo en un sitio de inicio.

Al mismo tiempo, otra célula responde predominantemente al sorbitol, donde el sitio de inicio de S TL one está etiquetado en verde. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y visualizar moléculas individuales de ARNm en levadura una vez dominadas. Esta técnica se puede realizar correctamente en dos días.

Recuerde tener una concentración suficientemente densa de células. Las muestras diluidas requieren que se generen y almacenen más campos.