Name: Usando dispersión mejorada por Nanoplasmon y imágenes de microscopio de baja magnificación para cuantificar exosomas derivados del tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende el ensayo nPES para cuantificar exosomas derivados de tumores sin necesidad de purificación previa. Este método rápido utiliza nanorods de oro y microscopía de campo oscuro para analizar biomarcadores en muestras clínicas pequeñas.

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El trabajo fue apoyado principalmente por la financiación de la investigación proporcionada por NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 y R21Al126361-01), el Premio de investigador joven de la Comisión de investigación biomédica de Arizona (ABRC).

1. preparación de sondas de nanopartículas
Nota: este ensayo utiliza nanorods de oro funcionalizados (AuNRs; 25 nm de diámetro x 71 nm de longitud) que están conjugados covalentemente con polímeros de neutravidina (AV) y tienen un pico de resonancia de Plasmon superficial que produce una señal de dispersión roja (pico de 641 nm) sobre DFM Iluminación.
<ol><li>Lavar 40 μL de AuNR-AV (2,56 x 1011 partículas) tres veces con 200 ΜL de PBS (pH 7,0) por centrifugación y aspiración (8.500 x g a 4 ° c durante 10 minutos), seguida de una centrifugación final y paso de aspiración tras la cual se suspende el pellet de aunr-AV en 40 μL de PBS.</li>
	<li>Mezclar esta suspensión aunr-AV con 10 μl de anticuerpo biotinilado (0,5 mg/ml) específico para un antígeno en la superficie del subtipo de interés exosomas y 150 μL de PBS y luego mezclar a 4 ° c durante 2 h utilizando un mezclador para permitir la Unión de neutravidina-biotina para alcanzar la terminación.</li>
	<li>Lavar tres veces los AuNRs conjugados con anticuerpos (AuNR-IgG) por centrifugación y aspiración (6.500 x g a 4 ° c durante 10 minutos) y, a continuación, suspenderlos en 200 ΜL de PBS y almacenarlos a 4 ° c hasta su uso. Nota: la técnica estéril y los tiempos de almacenamiento cortos deben utilizarse para evitar la contaminación y la degradación de la AuNR-IgG. Es mejor utilizar las tías conjugadas con anticuerpos dentro de las 24 horas de su conjugación.</li>
</ol>2. preparación de diapositivas de captura de EV
<ol><li>Diluir los anticuerpos de captura de exosomas seleccionados a 0,025 mg/ml en PBS y añadir 1 μl/pozo de esta dilución en una diapositiva a/G de proteína multi-pozo, y luego incubar esta diapositiva a 37 ° c durante 1 h en una cámara humidificada para permitir la Unión de anticuerpos de captura a la proteína a/G inmovilizada en la diapositiva.</li>
	<li>Aspirar pozos para eliminar los anticuerpos sin consolidar, y lavar los pozos tres veces por la adición y aspiración de 1 μL/pozo de PBS, luego cargar cada pozo con 1 μL de tampón de bloqueo (ver tabla de materiales) e incubar la corredera durante 2 h a 37 ° c en una cámara humidificada para b bloquear los sitios de unión a proteínas restantes.</li>
	<li>Aspiran pozos para eliminar el tampón de bloqueo, lavar los pozos tres veces por la adición y aspiración de 1 μl/pozo de PBS, y utilizar inmediatamente las diapositivas bloqueadas para la captura y el análisis de exosomas.</li>
</ol>3. preparación de la curva estándar
<ol><li>Para cuantificar con precisión la abundancia absoluta o relativa de un subtipo exosomas específico, el usuario debe generar una curva estándar con una población de exosomas pura que exprese uniformemente el biomarcador superficial exosomas de interés. Este estudio analiza la abundancia de exosomas que expresan una proteína de membrana asociada a la metástasis, el receptor de ephrin a2, que tiene una relación informada con la etapa del cáncer pancreático y el pronóstico6,18. Nota: la línea celular de cáncer de páncreas humano PANC-1 y sus exosomas se sabe que expresan esta proteína y exosomas aislados de esta línea celular se utilizaron para generar una curva estándar para cuantificar el número de exosomas que expresan esta proteína en exosoma complejo Muestras.</li>
	<li>Células de cultivo para 48 horas a 37 ° c en medios de cultivo libres de suero para permitir la acumulación de exosomas en los medios, luego aislar los sobrenadantes de cultivos celulares por centrifugación de cultivos de suspensión o aspiración directa de medios de cultivo de cultivos celulares adherentes.</li>
	<li>Centrifugar los medios recogidos a 2000 x g durante 30 minutos para eliminar los desechos y recuperar el sobrenadante.</li>
	<li>Filtre el sobrenadante de cultivo clarificado a través de una unidad de filtro de baja proteína de 0,45 μm de capacidad adecuada (p. ej., una unidad de filtración de vacío Polietersulfona de 250 mL).</li>
	<li>Concentrar el filtrado resultante por centrifugación a 3200 x g utilizando un sistema de filtro de límite de peso molecular nominal 100.000 a un volumen final de 250 μl. Recoja el volumen retenido de este filtro, luego lave el filtro con 200 μL de PBS, y combine este volumen de lavado con el volumen de muestra de exosomas recogido.</li>
	<li>Centrifugar esta muestra a 21.000 x g durante 45 minutos y recuperar cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no recolectar ningún material precipitado.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante recuperado a 100.000 x g durante 3 horas para precipitar los exosomas. Aspire el sobrenadante y recoja el pellet de exosomas en 100 μl de PBS.</li>
	<li>Almacene las suspensiones exosomas resultantes a 4 ° c si se utiliza dentro de las 24 horas o a-80 ° c para almacenamiento a largo plazo. Nota: No someta las muestras exosomas a repetir ciclos de congelación-deshielo.</li>
	<li>Cuantificar una alícuota de la suspensión exosomas después de la mezcla mediante la medición directa de números exosomas (p. ej., mediante análisis de rastreo de nanopartículas o detección de pulso resistivo ajustable o midiendo la concentración proteica de lisatos de exosomas por micro-bicinchoninic ensayo ácido, o un método equivalente, como un medio para aproximar la cantidad de exosomas)16,19.</li>
	<li>Generar un conjunto de diluciones seriales de la suspensión exosomas para permitir la comparación de la señal de nanopartículas para introducir el número de exosomas o contenido de proteína.</li>
	<li>Transferir 1 μl de cada exosomas estándar a cada uno de sus pozos replicantes en la placa de ensayo. Nota: las curvas estándar se pueden utilizar para calcular la pendiente de la línea de correlación entre la señal de nanopartícula y la concentración de exosomas a (1) evaluar el rendimiento del ensayo y (2) determinar la concentración relativa de los exosoma objetivo en muestras experimentales.</li>
</ol>4. procesamiento de muestras de plasma o suero humanos
<ol><li>Recoger muestras de plasma o suero por métodos estándar y almacenar a-80 ° c hasta que sea necesario para el análisis exosomas. Descongelar rápidamente las muestras en un baño de agua a temperatura ambiente. Mezclar repetidamente las muestras descongeladas por inversión para promover la suspensión homogénea. Nota: los resultados de muestras de suero y plasma pueden no ser equivalentes, ya que hay una liberación significativa de exosomas durante la reacción de coagulación.</li>
	<li>Centrifugar muestras de plasma o suero a 500 x g durante 15 minutos para precipitar agregados de proteínas y otros desechos. Transfiera una alícuota de la muestra de plasma o suero a un tubo fresco y añada PBS para generar una dilución de 1:1. Mezclar la muestra diluida mediante un vórtex o inversión suave, según proceda. Transferir 1 μL de cada suspensión de plasma o suero a cada uno de sus pozos replicantes en la placa de ensayo.</li>
</ol>5. captura y detección de exosome
<ol><li>Los pozos de carga de una diapositiva de captura EV bloqueada con 1 μl/pozo de muestra de exosomas, utilizando 8 réplicas por muestra, e incubar la diapositiva durante la noche a 4 ° c en una cámara humidificada. Aspirar todos los pozos de muestras y luego añadir 1 μL/pozo de PBS para lavar los pozos y eliminar los exosomas sin consolidar y otros contaminantes de la muestra de exosoma cargada.</li>
	<li>Cargue los pozos de muestras con 1 μL/pozo de una suspensión AuNR-IgG previamente preparada (véase la sección 1 anterior) e incube la corredera durante 2 h a 37 ° c en una cámara humidificada. Aspire la solución de nanopartículas y lave el portaobjetos en PBS complementado con 0,01% Tween-20 (PBST) durante 10 min usando un mezclador, luego aspire y lave todos los pozos de muestras con agua desionizada durante 10 min usando un mezclador giratorio y seque al aire para las imágenes posteriores del LMDFM. Nota: los coeficientes de variación del Inter-ensayo (CVs) se evalúan a partir de ocho réplicas de la misma muestra. Las muestras que exhiben CVs > 20% se consideran no informativas y deben repetirse, si hay suficiente muestra.</li>
</ol>6. captura de imagen DFM
<ol><li>Capture imágenes para la cuantificación de exosomas bajo una iluminación consistente usando una cámara digital unida a un microscopio equipado con un condensador de campo oscuro (1,2 < na < 1,4) y un objetivo 4x empleando un tiempo de exposición de 1/220 s.</li>
	<li>Abra el software de captura de imágenes. Nota: utilizamos el software de imagen de microscopio NIS-Elements (ver tabla de materiales) para el protocolo descrito a continuación, pero es posible utilizar otro software que puede coincidir con sus parámetros de captura de imagen. El software de imagen NIS-Elements Viewer es un programa independiente gratuito para ver archivos de imágenes y conjuntos de datos que contienen herramientas de análisis, visualización y archiving. Los siguientes parámetros son también para un microscopio con autofocus y una etapa automatizada que permite que múltiples imágenes sean capturadas automáticamente y cosidas en una sola imagen.</li>
	<li>Coloque la diapositiva boca abajo en la etapa del microscopio, ajuste la posición de la diapositiva y aplique una pequeña gota de aceite de inmersión en la parte posterior de la diapositiva, donde la lente del condensador se pone en contacto con la diapositiva.</li>
	<li>Haga clic en el botón Live en la interfaz del software y ajuste el tiempo de exposición con un estándar de alta concentración para garantizar que la imagen no esté saturada.</li>
	<li>Abra la ventana escanear imagen grande desde la pestaña adquirir y establezca los parámetros de la interfaz de software de la siguiente manera: macro imagen óptica conf = corriente; Objetivo: 2:10x, escaneo óptico conf = corriente, objetivo: 2:10x; Costura solapamiento = 20%; Costura vía = ruta óptima.</li>
	<li>Seleccione crear imagen grande, cierre el obturador activo duranteel movimiento de la etapa, espere antes de cada captura: 20 MS, enfoque manualmente al inicioy Utilice el enfoque paso a paso cada 20 campos. Estos ajustes se guardarán con las imágenes escaneadas.</li>
	<li>Mueva la etapa del microscopio para definir los límites inferiores izquierdo superior derecho del campo de escaneo de destino. Ajuste el enfoque para lograr una imagen clara en el monitor y ajuste los ajustes del condensador y la iluminación ambiental según sea necesario para minimizar cualquier irregularidad de iluminación en la imagen enfocada.</li>
	<li>Asigne un nombre al archivo de salida de imagen en el software. Haga clic en el botón escanear y permita que el microscopio escanee y cree y guarde una imagen cosida de toda la diapositiva.</li>
	<li>Abra la imagen guardada con el software de captura de imagen que está utilizando y guárdelo a una escala de 1/8 para su posterior análisis en el complemento de DSM en ImageJ.</li>
</ol>7. Análisis de imagen DFM
<ol><li>Descargue el programa ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Instale el plugin del algoritmo DSM en ImageJ usando las instrucciones enumeradas en https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.</li>
	<li>Abra el software ImageJ y, a continuación, establezca los siguientes parámetros de entrada dentro del algoritmo DSM: umbral de contorno (CT) = 253,020, tipo = rojo, escala (S) central = 0,8, límite de cuantificación bajo (lt)/alto (HT) = 0/62.</li>
	<li>Abra la imagen guardada de la sección 6,8 con ImageJ. Elija el botón DSM Scan en la pestaña plugins y, a continuación, defina el número de columnas y filas según la imagen abierta. El programa puede reconocer las áreas de detección y el análisis de la intensidad de dispersión de la nanopartícula en áreas de acuerdo automáticamente. Establezca los siguientes parámetros de entrada dentro de la ventana de escaneo de DSM : porcentaje de cambio de tamaño = 25, diámetro de Spot (en píxeles) = 190 – 200, rango de diámetro = 32, diámetro de incremento (en píxeles) = 8, configuración de DSM-baja Limit = 0, límite alto = 62, distancia adyacente = 100, restar sesgo = 0. Nota: los resultados de la dispersión de la intensidad de la nanopartícula reflejan la cantidad de exosomas enlazados en la diapositiva.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Los exosomas surgen de las invaginaciones reguladas de la membrana endosoma externa que producen cuerpos multivesiculares, un subconjunto especializado de endosomas que contienen un gran número de vesículas intraluminales que se someten a la fusión con la membrana plasmática para liberar exosomas en el espacio extracelular. Debido a esta vía de la biogénesis, los exosomas pueden llevar factores ligados a la membrana asociados con fracciones de membrana que comprenden o se fusionan con la membrana endosoma, así como múltiples tipos diferentes de componentes citosólicos, y por lo tanto contienen cargas de proteínas, ADN y varios subtipos de ARN (mRNAs, microRNAs, RNAs de no codificación largos) que pueden reflejar el fenotipo de su célula de origen20. Dado que los exosomas son secretados por la mayoría de los tipos de células, si no todos, pueden exhibir mayor secreción de células enfermas o malignas, y acumularse en la mayoría de los fluidos corporales, los exosomas son objeto de una investigación exhaustiva y sistemática como una promesa mínimamente medios invasivos para detectar afecciones específicas de la enfermedad y monitorear sus respuestas al tratamiento21.
El aislamiento exosomas, que se requiere para la mayoría de los análisis de exosomas actuales, es un procedimiento prolongado y laborioso, restringiendo la traducción clínica de biomarcadores asociados a exosomas con posible relevancia médica. Muchos métodos comunes de aislamiento (ultracentrifugación, exclusión de tamaño, precipitación, etc.) a menudo no distinguen suficientemente los exosomas (30 – 100 nm) de las microvesículas (100 – 1000 nm) y los cuerpos apopónticos (100 – 5000 nm) debido a superposiciones en sus rangos de tamaño o propiedades físicas o pueden dañar la integridad de exosomas15. Se están en desarrollo nuevos enfoques que pueden permitir análisis más rápidos de exosomas, pero no está claro cuán factible puede ser implementar muchas de estas plataformas en entornos clínicos debidos.
En este informe, presentamos un enfoque novedoso que permite la cuantificación de exosomas de alto rendimiento basada en nanopartículas utilizando imágenes de microscopio de campo oscuro de bajo aumento. Este método no requiere exosomas purificación, costoso equipo dedicado, o experiencia técnica novedosa y por lo tanto debe ser susceptible a la rápida traducción en la mayoría de la investigación y los entornos clínicos. Nuestro ensayo se puede aplicar para cuantificar con precisión la concentración de una población de exosomas objetivo que lleva un biomarcador específico cuando los resultados del ensayo se comparan con una curva estándar, ya que nuestros resultados muestran que hay una fuerte correlación lineal (R2 = 0,99) entre la respuesta óptica y la concentración de exosomas. Para demostrar el potencial del mundo real de este enfoque, hemos proporcionado datos donde se empleó este método para cuantificar la concentración de un biomarcador exosomas asociado con el cáncer de páncreas en muestras de suero obtenidas de pacientes con y sin cáncer pancreático.
En LMDFM, todo el pozo de muestra se imagina para evitar el sesgo de selección que se encuentra en los análisis de DFM de alta magnificación, donde los usuarios deben elegir directamente los campos de muestra para capturar para el análisis de imagen subsiguiente, pero están sujetos a artefactos de dispersión de luz de superficie irregularidades, como arañazos y restos de muestras. Este fondo se puede reducir para detectar la señal derivada de exosome objetivo utilizando nuestro algoritmo de reducción de ruido DSM que se ejecuta en el programa de análisis de imagen NIH, ImageJ, pero todavía se debe tener cuidado para evitar la introducción de tales artefactos que pueden reducir el rango dinámico de el ensayo.
Materiales utilizados en este ensayo:
Las diapositivas SuperProtein A/G multipozo que sostienen 1 μL/pozo fueron compradas a Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Se obtuvieron nanopartículas de Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). Las imágenes DFM fueron capturadas con una cámara digital Nikon DiR2 conectada a un microscopio Nikon ti-Eclipse, con una iluminación consistente y un tiempo de exposición de 1/220 s. La línea de células PANC-1 utilizada en este estudio fue comprada a la American Type Culture Collection.

Los exosomas se liberan de la mayoría de los tipos celulares y desempeñan un papel clave en las comunicaciones de célula a célula, incluidos los procesos fisiopatológicos asociados con diversas enfermedades, ya que pueden ser el hogar de determinados tejidos o tipos celulares, y contienen una variedad de ácidos nucleicos , proteínas y lípidos que reflejan su célula de origen y pueden ejercer efectos regulatorios sobre las células de los receptores1,2,3,4. Los exosomas a menudo se secretan a niveles elevados en los Estados de la enfermedad, pueden interactuar con las células adyacentes y distantes, y se encuentran en una concentración relativamente alta en la circulación, así como la mayoría de los otros fluidos corporales, incluyendo la saliva, la orina, el páncreas y la bilis jugo, y el líquido de lavado broncoalveolar5,6,7,8,9,10,11. Esta abundancia y estabilidad de exosomas en fluidos corporales humanos, junto con su naturaleza rica en información, los convierte en biomarcadores ideales para el diagnóstico de enfermedades y el monitoreo del tratamiento.
Esto incluye los exosomas derivados del tumor (TDEs), que contienen factores específicos del tumor o selectivos, que pueden servir como biomarcadores de la enfermedad, incluidos los alelos mutantes asociados al tumor. Los TDEs pueden participar en la remodelación del microambiente tumoral para facilitar el desarrollo tumoral y la metástasis, y regulan las respuestas antitumorales12. El aumento de la secreción de TDE es un fenotipo común de la mayoría de los cánceres y varias características del microambiente tumoral, incluyendo la hipoxia, el pH ácido y la inflamación, son conocidos por promover la secreción de exosomas. Sorprendentemente, dado el número de células que secretan exosomas, un aumento en el nivel total de exosoma puede, en sí, funcionar como un biomarcador de cáncer. Por ejemplo, un estudio reciente encontró que la concentración total de EV en el jugo de bilis discrimina a los pacientes malignos y no malignos en la estenosis del conducto biliar común con 100% de precisión7. Se han encontrado resultados similares con estudios que utilizan otros fluidos corporales, incluyendo plasma. Sin embargo, debido al potencial de variación de sujeto y otros factores de confusión, la mayoría de los estudios que investigan los exosomas como biomarcadores de la enfermedad se han centrado en la detección de biomarcadores que se asocian selectivamente con TDEs en lugar de exosoma total Números.
Sin embargo, traducir los biomarcadores de exosomas en la práctica clínica sigue siendo un reto, ya que la mayoría de los enfoques de ensayos exosomas requieren procedimientos de aislamiento laboriosos y laboriosos 13. Actualmente, los métodos de aislamiento exosomas populares incluyen la ultracentrifugación, los degradados de densidad, la exclusión de tamaño, la coprecipitación, la captura de afinidad y los enfoques de aislamiento de microfluidos. La ultracentrifugación es el método de "patrón de oro", y se utiliza más comúnmente para los aislamientos de exosomas, pero este procedimiento consume mucho tiempo y resulta en un daño de exosomas y en la agrupación de membranas exosomas, y produce exosomas muestras que están contaminadas con proteínas, lipoproteínas y otros factores que pueden influir en los análisis posteriores14. La mayoría de los métodos de aislamiento exosoma, incluyendo la ultracentrifugación, no pueden separar los exosomas (30 – 150 nm) de las microvesículas (100 – 1000 nm) y los cuerpos apopónticos (100 – 5000 nm), que surgen a través de diferentes mecanismos y tienen diferentes funciones, debido al tamaño solapamiento entre estos grupos, y la diversidad de las poblaciones de exosomas15. Se necesitan nuevos enfoques para mejorar la sensibilidad y la reproducibilidad de los ensayos exosomas mediante la mejora de la recuperación de exosomas, reduciendo al mismo tiempo el daño y la contaminación exosomas, aunque los ensayos basados en tales métodos también deberán optimizarse para hacerlos adecuado para la traducción a aplicaciones en entornos clínicos.
Varios estudios recientes han propuesto emplear plataformas integradas para capturar y analizar exosomas directamente de fluidos corporales. Estos métodos emplean microfluidos, electrocinéticos, captura de afinidad, y varios otros métodos para el aislamiento exosoma, y la electroquímica, resonancia de Plasmon superficial, y otros métodos para detectar exosomas capturados. No está claro cuán factible serán muchos de estos enfoques en entornos clínicos, debido a su complejidad, gastos, bajo rendimiento u otros problemas.
Hemos desarrollado un ensayo rápido y económico que puede ser utilizado para la cuantificación sensible y específica de exosomas totales y subtipos de exosoma específicos, incluyendo exosomas asociados a la enfermedad, tales como TDEs, que requiere sólo una pequeña cantidad de muestra y que emplea un flujo de trabajo optimizado adecuado para entornos clínicos. En este ensayo, una diapositiva se recubre con anticuerpos que unen un marcador específico de exosoma o específico de la enfermedad expresado en la superficie exosoma para capturar directamente los exosomas objetivo presentes en muestras de plasma o suero de pequeño volumen aplicadas a los pozos en el Deslice. Los exosomas capturados son entonces hibridados con una nanopartícula conjugada con anticuerpos que reconoce el biomarcador de interés en estos exosomas, que puede ser un marcador de exosoma general o un factor específico para un subtipo de interés exosoma. Las imágenes de estos pozos de muestra se capturan utilizando un microscopio de campo oscuro (DFM) y se analizan para medir la luz dispersa de nanopartículas ligadas a exosomas de interés capturados en cada muestra bien6,16,17. En particular, la toma de imágenes de una muestra completa por DFM de baja ampliación (LMDFM) evita un sesgo de selección encontrado con análisis DFM de alta magnificación cuando los usuarios deben elegir directamente qué campos capturar para el análisis de imagen subsiguiente. El análisis de imágenes LMDFM está sujeto a artefactos de dispersión de luz de irregularidades superficiales, incluidos arañazos y desechos de muestras, pero este fondo se puede reducir utilizando un algoritmo de reducción de ruido simple que desarrollamos para ejecutarse en el programa de análisis de imagen NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Este algoritmo aplica primero un umbral de contorno de entrada que se utiliza para detectar los límites del pozo de muestra para definir la región de la imagen para su posterior análisis. La región definida por esta región de contorno se divide a continuación para separar la señal presente en los canales rojo, azul y verde de la imagen y el canal azul se resta del canal rojo para eliminar la señal derivada de los artefactos superficiales y la iluminación irregular de nanorod Señal.
Este artículo describe cómo utilizar este ensayo para cuantificar rápidamente los niveles de exosomas totales o específicos en muestras de plasma o suero.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Repeater stream</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-040</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td>0.1 &ndash; 2.5 &micro; L, gris oscuro</td></tr><tr><td>Nanovarillas de oro funcionalizadas</td><td>Nanopartz</td><td>C12-25-650-TN-DIH-50-1</td><td>Funcionalización in vitro del polímero de neutravidina</td></tr><tr><td>HulaMixer Mezclador de muestras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Incu-shaker 10L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de investigación invertido</td><td>Nikon</td><td>Ti-DH</td><td>Con condensador de campo oscuro, cámara DS-Ri2 y soporte universal Ti-SH-U, y platina motorizada</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio software de imagen</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (1X)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30256.02</td><td>HyClone</td></tr><tr><td>Protein A/G Diapositivas de sustrato de vidrio tratado</td><td>Arrayit Corp.</td><td>AGMSM192BC</td><td>Sustrato de microarray de primera calidad</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td>Q500-110</td><td>Con sonda estándar (#4220)</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

usando dispersión mejorada por nanoplasmon y imágenes de microscopio de baja magnificación para cuantificar exosomas derivados del tumor

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Las células infectadas o malignas secretan con frecuencia más exosomas, lo que lleva a niveles elevados de exosomas asociados a la enfermedad en la circulación. Estos exosomas tienen el potencial de servir como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades y para monitorear la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos de análisis exosomas requieren exosomas aislamiento y pasos de purificación, que suelen ser lentos y laboriosos, y por lo tanto de utilidad limitada en entornos clínicos. Este informe describe un procedimiento rápido para analizar biomarcadores específicos en la membrana externa de los exosomas sin necesidad de separar los pasos de aislamiento y purificación. En este método, los exosomas se capturan en la superficie de una diapositiva mediante anticuerpos específicos de exosoma y luego se hibridizan con sondas de anticuerpos conjugados con nanopartículas específicas de una enfermedad. Después de la hibridación, la abundancia de la población de exosomas objetivo se determina analizando imágenes de microscopio de campo oscuro de bajo aumento (lmdfm) de las nanopartículas enlazadas. Este enfoque se puede adoptar fácilmente para la investigación y el uso clínico para analizar biomarcadores de exosomas asociados a la membrana vinculados a la enfermedad.

Las diapositivas recubiertas A/G de proteína multipozo (figura 1A) se funcionalizaron con anticuerpos anti-EphA2 y luego se utilizaron para capturar específicamente exosomas EphA2 positivos de muestras de suero de pacientes con y sin cáncer de páncreas (1 μl/pozo) e incubados con nanorods dorados conjugados con un anticuerpo anti-CD9 (figura 1B). Las imágenes DFM de luz dispersadas de estas nanopartículas se analizaron utilizando el plugin DSM en el software ImageJ para cuantificar los exosomas positivos EphA-2 en cada pozo. El algoritmo DSM define automáticamente el contorno de un pozo de muestra, filtra el ruido de los artefactos, calcula la señal dispersa de cada pozo y emite esta información (figura 2). El algoritmo DSM atenúa fuertemente los artefactos de dispersión de luz de arañazos o escombros presentes en la muestra y mejora la sensibilidad y reproducibilidad de la detección de nanopartículas y puede procesar automáticamente un lote de imágenes de diapositivas para un alto rendimiento Uso. Este algoritmo utiliza comandos ImageJ y parámetros de entrada por el usuario para restar el fondo de la imagen, calcular la señal de dispersión de cada pozo, y salida de un archivo de datos e imagen (figura 3). Las regiones de interés se definen por los límites de pozo de alta intensidad en la imagen de captura utilizando la función de umbral de contorno del programa de macros ImageJ. Los análisis de imagen utilizan un umbral de contorno predefinido y parámetros de imagen para calcular la intensidad de la dispersión de nanopartículas para cada pozo.
Como se informó en nuestro trabajo anterior (información complementaria de Liang et al.6), exosomas aislados de cultivos celulares de PANC-1 caracterizados por microscopía electrónica de transmisión y Western Blot exhibieron el rango de tamaño, la morfología y el marcador proteico expresión consistente con una muestra de exosomas de alta pureza. Los exosomas PANC-1, preparados con el mismo procedimiento que nuestro trabajo anterior, se utilizaron aquí para validar nuestro ensayo de nPES para la cuantificación de exosoma. Este ensayo utilizó un anticuerpo anti-EphA2 para capturar una gran población de exosomas del total de la población exosoma y un anticuerpo contra la proteína exosoma general CD9 para detectar exosomas capturados. Los resultados obtenidos utilizando muestras de exosomas PANC-1 diluidas en serie, con concentraciones de proteínas que oscilan entre 0,24 y 1,2 μg/μl, mostraron buena reproducibilidad en pozos replicantes (figura 4a) y una fuerte correlación lineal entre la respuesta de dispersión y concentración de proteínas exosomas (Figura 4B).
Para demostrar la posible aplicación de este método, se analizaron muestras de suero de pacientes con y sin cáncer de páncreas para detectar la abundancia de exosomas séricos que expresan el biomarcador EphA2 asociado al cáncer, utilizando un anticuerpo anti-EphA2 para capturan directamente los exosomas objetivo de suero y nanopartículas conjugados con un anticuerpo anti-CD9 para detectar exosomas enlazados. Este análisis reveló que las muestras de suero de los pacientes con cáncer pancreático tenían niveles significativamente más altos de EphA2 + exosomas (figura 5) que sus controles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg"> Figura 1: esquema de cuantificación Exosome. (A) esquema de las diapositivas A/G de proteína multipozo (192 pozos) utilizadas en este ensayo. (B) los exosomas objetivo son capturados directamente a partir de muestras, incluyendo suero y plasma, por inmovilización superficial en el anticuerpo de captura (por ejemplo, anticuerpo anti-EphA2) atado a la corredera, y luego incubado con nanorods dorados conjugados con una detección anticuerpo (por ejemplo, anti-CD9 anticuerpo) antes del análisis por análisis de imagen DFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg"> Figura 2: cuantificación de Exosome aplicando el algoritmo DSM a imágenes LMDFM. Las imágenes de bajo aumento se procesan con el algoritmo DSM para eliminar la señal de fondo y los artefactos de señal que pueden surgir de arañazos, mezcla de huecos, escombros y una iluminación de muestra desigual para permitir una detección robusta de la señal de nanorod de oro, que se correlaciona con la concentración de exosomas. Esta cifra ha sido adaptada con el permiso de Sun, D. y otros. método de reducción de ruido para cuantificar la dispersión de la luz de nanopartículas en imágenes de campo lejano de microscopio de campo oscuro de bajo aumento. Química analítica. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) Sociedad química americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg"> Figura 3: esquema de los mandatos y salidas del algoritmo DSM. Los pasos indicados utilizan comandos nativos de ImageJ y todos los parámetros de entrada se seleccionan según los requisitos de los experimentos a través de la interfaz gráfica de usuario. Esta cifra ha sido adaptada con el permiso de Sun, D. y otros. método de reducción de ruido para cuantificar la dispersión de la luz de nanopartículas en imágenes de campo lejano de microscopio de campo oscuro de bajo aumento. Química analítica. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) Sociedad química americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg"> Figura 4: imágenes de nPES LMDFM representativas y datos de salida de DSM. (A) imagen lmdfm de un ensayo npes que analiza un gradiente de concentración de EXOSOMAS PANC-1 y (B) la correlación lineal de la señal óptica y la concentración exosoma de esta diapositiva (de izquierda a derecha: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μl respectivamente para cada columna). Los datos se presentan como media ± SE, n = 6, con un coeficiente de correlación de Pearson R2 = 0,99 y coeficiente de variación para las réplicas de cada concentración &lt; 0,2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg"> Figura 5: la señal de LMDFM de EphA2+ exosomas difiere en suero de pacientes con y sin cáncer de páncreas. Las muestras de suero analizadas por los nPES utilizando un anticuerpo de captura anti-EphA2 (asociado al cáncer) y un anticuerpo de detección anti-CD9 (marcador de exosoma general) mostraron una diferencia significativa en la concentración de exosomas de EphA2 + en muestras de suero de pacientes con y sin cáncer pancreático (N = 7/Grupo). Los resultados se presentan como media ± SE. * *p = 0,002 por la prueba U de Mann-Whitney (a dos caras). Esta figura ha sido modificada de [Sun, D. et al. método de reducción de ruido para cuantificar la dispersión de la luz de nanopartículas en el microscopio de campo oscuro de bajo aumento de imágenes de campo lejano. Química analítica. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La traducción clínica de biomarcadores derivados de exosome para células enfermas y malignas se ve obstaculizada por la falta de métodos de cuantificación rápidos y precisos. Este informe describe el uso de imágenes de microscopio de campo oscuro de bajo aumento para cuantificar subtipos específicos de exosomas en muestras de suero o plasma de pequeño volumen.

Usando dispersión mejorada por Nanoplasmon y imágenes de microscopio de baja magnificación para cuantificar exosomas derivados del tumor

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

La dispersión mejorada con nanoplasmón, o nPES, es una alternativa simple y no invasiva a la biopsia quirúrgica que puede omitir pasos de purificación de exosomas que consumen mucho tiempo y trabajan laborioso, expandiendo la aplicación del análisis de exosomas a entornos clínicos. Este ensayo nPES es un procedimiento rápido para analizar biomarcadores específicos en la membrana externa de los exosomas que no requieren pasos de aislamiento y purificación separados. Sólo necesitamos una muestra clínica muy pequeña para este ensayo.Por lo tanto, este método puede ampliar el uso de nPES para estudiar modelos de ratón DE ingeniería genética o PDX. Hay algunos pasos en este protocolo que pueden parecer desalentadors. Sin embargo, con algunas carreras de práctica, todos los usuarios con habilidades básicas de laboratorio húmedo pueden aprender a realizar con éxito nPES.Para iniciar el procedimiento, combine 40 microlitros de una suspensión de nanorods de oro funcionalizados por NeutrAvidin con 200 microlitros de solución salina fría y con pH siete tampones en fosfato. Centrifugar la mezcla a 8500 veces g a cuatro grados Centígrados durante 10 minutos, y retire el sobrenadante. Repita este proceso de lavado dos veces más, y luego resuspender las nanorods en 40 microlitros de PBS frío.A continuación, añada 150 microlitros de PBS frío y 10 microlitros de una solución de 0,5 miligramos por mililitro de los anticuerpos biotinilados adecuados para la suspensión. Mezclar a cuatro grados Celsius durante dos horas para obtener nanorods de oro conjugados con anticuerpos. Lavar las nanorods tres veces por centrifugación en porciones de 200 microlitros de PBS frío a 6500 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos cada una.Después, resuspender las nanorods conjugadas con anticuerpos lavados en 200 microlitros de PBS frío, y almacenarlos en cuatro grados Celsius durante un máximo de 24 horas. Para comenzar a preparar la diapositiva, diluya los anticuerpos de captura de exosoma deseados a 025 miligramos por mililitro en PBS. Pipetear un microlitro de esta solución en cada pozo de una diapositiva tratada con proteína A/G respaldada con vidrio de grado óptico.A continuación, transfiera el portaobjetos a una caja humidificadora para asegurarse de que los pozos no se sequen durante la incubación. Incubar el portaobjetos a 37 grados centígrados durante una hora para inmovilizar los anticuerpos de captura. A continuación, aspirar la solución restante para eliminar los anticuerpos no unidos.Lave los pozos añadiendo y aspirando un microlitro de PBS tres veces. A continuación, cargue rápidamente cada pozo con un microlitro de búfer de bloqueo basado en PBS, e incubar la diapositiva a 37 grados Celsius durante dos horas. Cuando se ejecutan alrededor de 15 muestras, debemos utilizar una pipeta de un solo canal para cargar el búfer de bloqueo en 120 pozos en menos de cinco minutos para evitar la evaporación del agente de bloqueo.Comience a preparar una solución de nanorods de oro conjugados con anticuerpos durante el bloqueo de diapositivas. Unos 30 minutos antes de bloquear los acabados, descongele rápidamente muestras de plasma o suero en un baño de agua a temperatura ambiente. Vórtice las muestras descongeladas durante 30 segundos para garantizar que las suspensiones sean homogéneas.Luego, centrifugar las muestras a 500 veces g durante 15 minutos para precipitar agregados proteicos y otros desechos. Transfiera alícuotas de 10 microlitros del sobrenadante a tubos frescos y haga diluciones uno a uno con PBS. Mezclar las muestras diluidas por vórtices suaves o inversión según corresponda.Cuando el bloqueo de diapositivas haya terminado, aspire el búfer de bloqueo y lave los pozos tres veces con porciones de un microlitro de PBS. Cargue inmediatamente las muestras en los pozos con un microlitro por pozo y ocho réplicas por muestra. Cargue los estándares de exosoma en los pozos apropiados de la misma manera.Incubar el portaobjetos durante 12 a 18 horas en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Luego, aspirar los pozos, y lavar cada uno bien una vez con un microlitro de PBS. Cargue un microlitro de la suspensión de nanorod de oro conjugado con anticuerpos en cada pozo, e incubar el portaobjetos a 37 grados Celsius durante dos horas.Después, aspirar la suspensión de nanorod, y lavar el portaobjetos en PBS complementado con 1%polisorbato 20 durante 10 minutos usando un mezclador. A continuación, aspirar los pozos y lavar el tobogán en agua desionizada durante 10 minutos en una mezcladora giratoria. Retire el agua y deje que el portaobjetos se seque al aire en un plato limpio de Petri antes de llevar el portaobjetos al microscopio de campo oscuro.Configure un microscopio invertido equipado con un condensador de inmersión de aceite de campo oscuro, un objetivo 4x y una etapa motorizada. Conecte el microscopio a un ordenador a través de una cámara digital y abra el software de imágenes. A continuación, coloque la diapositiva de la muestra boca abajo en la etapa del microscopio y aplique una pequeña gota de aceite de inmersión donde la lente del condensador entre en contacto con la diapositiva.Muestre la vista a través del microscopio en el software de imágenes. Ajuste el tiempo de exposición con respecto a un pozo estándar de alta concentración para asegurarse de que la imagen no se saturará. A continuación, abra la herramienta para escanear imágenes grandes y establezca el aumento objetivo en 10x.Elija cerrar el obturador activo durante el movimiento de la etapa y esperar 20 milisegundos antes de cada captura. Establezca la superposición de costura en 20% y seleccione la costura a través de la ruta óptima. Elija crear una imagen grande a partir del escaneo.Configure la cámara para que se enfoque manualmente al inicio del escaneo y habilite el enfoque automático paso a paso cada 20 campos. A continuación, elija establecer límites izquierdo, derecho, superior e inferior para el campo de exploración de destino y defina el área de exploración moviendo la etapa del microscopio a cada uno de los límites deseados. A continuación, ajuste el enfoque, el condensador y la iluminación del área para obtener una imagen clara y bien iluminada.Asigne un nombre al archivo de imagen que se va a crear e inicie el análisis. Cuando termine, abra la imagen y guárdela a escala 1/8. Abra el software de análisis de imágenes.A continuación, abra el menú Plugins, haga clic en DSM Scan, defina el número de columnas y filas, establezca el porcentaje de cambio de tamaño en 25, establezca el diámetro del punto, en píxeles, en 190 a 200, establezca el rango de diámetro en 32 y establezca el diámetro de incremento, en píxeles, en ocho. Establezca los límites de DSM bajos y altos en cero y 62, la distancia adyacente a 100 y el sesgo de resta en cero. Ejecute el algoritmo DSM y guarde los datos resultantes.La técnica de análisis de DSM mostró una buena reproducibilidad en muestras de exosoma PANC-1 diluidas en serie que oscilaban entre 0,24 y 1,2 microgramos por microlitro. Se observó una fuerte correlación lineal entre la respuesta de dispersión de las nanorods de oro y la concentración de proteínas exosomas. Se observó una diferencia significativa en la abundancia de exosomas séricos que expresan el biomarcador asociado al cáncer EphA2 entre pacientes con cáncer de páncreas y pacientes sanos.A partir de la adición del agente de bloqueo, el pipeteo rápido y preciso es crucial para evitar la evaporación de las muestras, introducir la contaminación cruzada y rayar la superficie de la diapositiva. Siguiendo este procedimiento, realizamos análisis estadísticos para investigar cualquier correlación entre la expresión del biomarcador exosomal de interés y la etapa diferente de la enfermedad que se está estudiando. Después de establecer esta tecnología, y podemos encontrar biomarcadores exosomales para cánceres de páncreas en estadio temprano.Actualmente, estamos expandiendo este descubrimiento a otros tipos de cánceres y enfermedades de infección. Por lo general, las muestras que se manejan en este ensayo son muestras de pacientes o muestras de exosomas purificadas de líneas celulares de cáncer, que requieren un entrenamiento de seguridad especial.

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