Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

El objetivo de este procedimiento es analizar los exosomas por su tamaño y cuantificarlos mediante el uso de un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas o NTA a través de un método semiautomatizado. Esto se logra mediante el uso de pasos de centrificación diferencial para obtener un pellet de exosoma a partir de sangre humana. Los exosomas se resuspenden a una concentración predeterminada para la cantidad de plasma inicial para obtener la intensidad de dispersión adecuada.

Durante la NTA, la suspensión se filtra para separar los exosomas de las partículas más grandes. A continuación, se realiza una calibración del instrumento NTA utilizando una suspensión de control que contiene partículas de poliestireno de 200 nanómetros. A continuación, la solución de exosomas se inyecta en el instrumento NTA y se selecciona la configuración ideal del NTA mediante la realización de una prueba previa antes de realizar la prueba final.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cuantificación de todas las partículas medidas y la lista de las partículas por sus tamaños. La demostración de este método es fundamental, ya que la solución y el ajuste de cada solución de exosoma preparada deben realizarse individualmente para obtener los mejores resultados. Los exosomas medidos deben estar en una concentración I para que el modo de visualización en vivo muestre alrededor de 600 partículas por pantalla.

Además, se debe realizar una prueba previa para encontrar el rango de sensibilidad óptimo para la medición. Un ajuste alto de sensibilidad conduce a la visualización de partículas más pequeñas, también aumentaría los problemas relacionados con los ruidos de fondo. El procedimiento será demostrado por Anto May, un estudiante graduado de nuestro laboratorio Para comenzar la preparación de exosomas, recoja sangre completa en tres tubos de citrato a través de venopunción para un total de nueve mililitros.

A continuación, vierta la sangre en una centrífuga de tubo Falcon de 15 mililitros y muestre la muestra a 1.500 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para iniciar la separación de las células del plasma. Transfiera el S naciente a un nuevo tubo Falcon de 15 mililitros. A continuación, vuelva a centrifugar la muestra a 2.800 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar todas las células del plasma.

Transfiera el plasma libre de células o CFP a tubos de ultracentrifugación a un mililitro por tubo. A continuación, centrifugar el CFP a 100.000 g durante 90 minutos a cuatro grados centígrados para agotar los exosomas. Retire 900 microlitros de sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en los 100 microlitros restantes en el tubo de ultracentrifugación.

Después de agregar 900 microlitros de centrífuga PBS, gana a 100, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Como antes, retire 900 microlitros del agente supino y vuelva a suspender los pellets con los 100 microlitros restantes. Transfiera de cinco a 20 microlitros de la suspensión Resus a 40 mililitros de agua destilada.

Filtre la suspensión a través de un filtro de 450 nanómetros para separar los exosomas de las partículas más grandes. Utilice esta suspensión final para la medición de partículas para utilizar el instrumento de seguimiento de partículas. Primero, inicie el programa haciendo doble clic en el icono del software.

Haga clic en las distintas pestañas del software para cambiar entre ellas en todo el protocolo. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla. Para una implementación automatizada del procedimiento de inicio, seleccione las casillas para la comprobación de calidad de celdas y la alineación automática.

Cualquiera de estos pasos se puede repetir por separado si es necesario presionando el botón A o B en la pestaña de verificación de celdas. Coloque un vaso de precipitados debajo del puerto de observación para recoger la solución de desecho y no inyecte burbujas de aire en el sistema. Abra el puerto de entrada y de perspectiva del instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas o NTA e inyecte 10 mililitros de agua destilada con una jeringa en el canal celular a través del puerto de entrada.

Cierre el puerto de entrada y salida inmediatamente cuando se inyecte la última cantidad de agua. Asegúrese de que la celda de medición esté libre de burbujas de aire. Realice la verificación de calidad de la celda haciendo clic en. Bien.

El software mostrará el resultado de la calidad de la celda después de unos segundos, si aún se visualiza alguna partícula en la pantalla de visualización en vivo del software, o si el resultado del control de calidad es solo bueno o malo, repita la inyección de agua distal hasta que las partículas restantes se eliminen de la celda de medición L. Repita este paso después de cada medición para evitar la acumulación de partículas. A continuación, prepare una suspensión de control que contenga partículas uniformes de poliestireno de 200 nanómetros. Para alinear los focos del láser y el microscopio, agregue una gota del concentrado de suspensión proporcionado por el fabricante del instrumento a 500 mililitros de agua destilada, lo que da como resultado la concentración requerida de modo que se muestren 600 partículas más o menos 100 por pantalla en la vista en vivo.

Inyecte la suspensión de alineación en el instrumento NTA como se hace para la prensa de agua destilada. Está bien comenzar también la alineación, que es una rutina automatizada a través de la cual el sistema encontrará automáticamente la posición óptima de los dos focos. Cuando aparezca un mensaje que indique que el sistema ya está listo para los experimentos, haga clic en Aceptar para iniciar la medición.

De vez en cuando, limpie el canal celular manualmente entre experimentos enjuagando la celda con una solución al 30% de etanol. Limpie el canal cada vez que el software muestre un informe de error automático. Para realizar la medición del sistema.

Primero, enjuague el canal con agua destilada antes de cada medición de muestra. A continuación, inyecte la suspensión del exosoma en el canal. El siguiente paso es ajustar los parámetros principales en el software para ajustar la sensibilidad.

Encuentre el rango de sensibilidad óptimo haciendo clic en número de partículas frente a sensibilidad para mostrar una curva de partículas medidas por pantalla para diferentes niveles de sensibilidad. Elija un nivel de sensibilidad antes de la pendiente máxima de la curva. Un nivel de sensibilidad más alto permite la visualización de partículas más pequeñas, pero también aumenta los problemas relacionados con el ruido de fondo.

Para ajustar el brillo mínimo, elija un brillo inicial de 20 para la medición de exosomas. Para utilizar esta función como filtro, regule este parámetro hasta que se borren las partículas que dispersan la luz intensamente. Reregula hacia abajo para amplificar los artefactos de dispersión semanales, con mucho brillo según sea necesario a lo largo del experimento.

A continuación, configure un filtro digital para eliminar el ruido de píxeles y las partículas de gran tamaño dispersas no deseadas. Al regular el tamaño mínimo y máximo, utilice un rango de 10 a 500 píxeles para la medición de exosomas. Ajuste el obturador cambiando el período de tiempo que la cámara está abierta ajustando el obturador a 300, que es igual a 3,3 milisegundos.

Para ajustar los parámetros de lectura en vivo, cambie entre un modo de vista digital y analógico en cualquier momento haciendo clic en el botón de imagen en vivo. A lo largo del experimento. Supervise la barra de intensidad de dispersión, que muestra el estado de saturación de la muestra como un indicador codificado por colores.

No analice los exosomas si la barra de dispersión es roja. Para comenzar la medición, haga clic en la pestaña de medición. Elija la configuración en la matriz de opciones de ejecución.

Antes de cada adquisición, seleccione el movimiento de control, una prueba de deriva de partículas de verificación repetida, seleccione el número de experimentos y el retraso de tiempo entre ellos. Realice una comprobación de la muestra si es necesario. Finalmente, haga clic en el botón Ejecutar adquisición de video.

En la nueva ventana, defina el número de ciclos y el número de posiciones de medición. Confirme la duración mínima. Se realiza un seguimiento de una partícula para que se cuente como una partícula individual.

Al establecer la resolución del vídeo, una resolución más baja da como resultado una duración de seguimiento más corta. Finalmente, seleccione un nombre de archivo y haga clic en aceptar para iniciar la medición. La curva de número de partículas frente a sensibilidad muestra las partículas en una posición en un momento dado.

Durante un escaneo automático de sensibilidad, se elige un valor de sensibilidad antes de la pendiente máxima del gráfico. Los artefactos no se eliminan en este experimento de prueba y pueden afectar al gráfico. La visualización de partículas en la pantalla de visualización en vivo es útil para establecer el valor de sensibilidad correcto.

Un valor demasiado bajo conduce a la detección de pocas partículas. Mientras que un valor demasiado alto muestra una imagen pobre, las partículas de calidad aparecen como puntos individuales bien aislados entre sí en el nivel de sensibilidad óptimo. La pestaña de resultados después de la medición permite la lectura de los parámetros, incluido el número total de partículas trazadas, el número promedio de partículas por posición y la concentración de partículas, así como la relación numérica entre el tamaño de partícula y el porcentaje de números de partículas.

El gráfico calculado después de la medición muestra la distribución de las partículas por tamaño. Los iconos en el modo de visualización se pueden usar para cambiar la configuración del gráfico. Además, hay diferentes formas de analizar los exosomas.

Este método muestra un método muy simple y elegante para realizar un análisis de método similar en un proceso rápido para generar resultados en poco tiempo. Para comparar varias muestras, recomendamos mantener el mismo nivel de dilución para todas las muestras. Todas las configuraciones aceptan la sensibilidad y la resolución del video se puede cambiar posteriormente mediante el uso del conjunto de algunos software de análisis.

De esta manera, el análisis comparativo de los datos obtenidos en diferentes experimentos sobre la cantidad y el tamaño de los exosomas está disponible de forma semiautomática.