Cuantificación basada en nanopartículas conjugadas con anticuerpos mediante microscopía de campo oscuro: un procedimiento para capturar y cuantificar exosomas específicos de fluidos corporales

Los exosomas son pequeñas estructuras encerradas en membranas que son secretadas por las células en el espacio extracelular. Los exosomas están presentes en abundancia en los biofluidos.

Para identificar y capturar exosomas específicos de los fluidos corporales, comience tomando un portaobjetos de inmunoensayo de pocillos múltiples. Este portaobjetos está funcionalizado con proteínas que actúan como antígenos y se unen a anticuerpos específicos.

Complemente el portaobjetos con la solución de anticuerpos primarios deseada e incube. Estos anticuerpos se unen a los antígenos prerrecubiertos en la superficie del portaobjetos.

Aspirar la solución restante para eliminar los anticuerpos no unidos. Ahora, agregue un tampón de bloqueo que bloquee los antígenos libres, evitando así la unión inespecífica de los exosomas.

A continuación, retire el tampón de bloqueo, cargue los exosomas que contienen la suspensión de suero en el portaobjetos e incube. Esto permite la unión exclusiva de exosomas específicos de la diana a los anticuerpos primarios capturados.

A continuación, cargue una suspensión de anticuerpos secundarios conjugados con nanopartículas de oro en la superficie del portaobjetos. Estos anticuerpos se adhieren a los exosomas preunidos y forman un complejo de detección.

Finalmente, con una pipeta, deseche los anticuerpos secundarios no unidos. Visualice los portaobjetos bajo un microscopio de campo oscuro. Las nanopartículas de oro presentes en la superficie de los exosomas dispersan la luz y aparecen como puntos brillantes contra el fondo oscuro.

Para comenzar a preparar el portaobjetos, diluya los anticuerpos de captura de exosomas deseados a 0,025 miligramos por mililitro en PBS. Pipetee 1 microlitro de la solución en cada pocillo de un portaobjetos tratado con proteína A / G respaldado con vidrio de grado óptico. Luego, transfiera el portaobjetos a una caja humidificadora para asegurarse de que los pocillos no se sequen durante la incubación.

Incube el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 1 hora para inmovilizar los anticuerpos de captura. Luego, aspire la solución restante para eliminar los anticuerpos no unidos. Lave los pocillos agregando y aspirando 1 microlitro de PBS tres veces. A continuación, cargue rápidamente cada pocillo con 1 microlitro de tampón de bloqueo basado en PBS e incube el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 2 horas.

Cuando se ejecutan alrededor de 15 muestras, debemos usar una pipeta de un solo canal para cargar el tampón de trabajo en 120 pocillos en menos de 5 minutos para evitar la evaporación del agente bloqueante.

Comience a preparar una solución de nanovarillas de oro conjugadas con anticuerpos durante el bloqueo de portaobjetos. Aproximadamente 30 minutos antes de que termine el bloqueo, descongele rápidamente las muestras de plasma o suero en un baño de agua a temperatura ambiente. Agite las muestras descongeladas durante 30 segundos para asegurarse de que las suspensiones sean homogéneas. Luego, centrifugar las muestras a 500 x g durante 15 minutos para precipitar agregados de proteínas y otros desechos.

Transfiera 10 alícuotas de microlitros de los sobrenadantes a tubos frescos y haga diluciones uno a uno con PBS. Mezcle las muestras diluidas mediante vórtice suave o inversión según corresponda. Cuando haya terminado el bloqueo del portaobjetos, aspire el tampón de bloqueo y lave los pocillos tres veces con porciones de 1 microlitro de PBS. Cargue inmediatamente las muestras en los pocillos con 1 microlitro por pocillo y 8 réplicas por muestra.

Cargue los estándares de exosomas en los pocillos apropiados de la misma manera. Incube el portaobjetos durante 12 a 18 horas en un refrigerador a 4 grados centígrados. Luego, aspire los pocillos y lave cada pocillo una vez con 1 microlitro de PBS. Cargue 1 microlitro de la suspensión de nanovarillas de oro conjugadas con anticuerpos en cada pocillo e incube el portaobjetos a 37 grados Celsius durante 2 horas.

A continuación, aspire la suspensión de nanovarillas y lave el portaobjetos en PBS suplementado con polisorbato-20 al 0,01% durante 10 minutos con una batidora. Luego, aspire los pocillos y lave el portaobjetos en agua desionizada durante 10 minutos en un mezclador giratorio. Retire el agua y deje que el portaobjetos se seque al aire en una placa de Petri limpia antes de llevar el portaobjetos al microscopio de campo oscuro.