Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.

El objetivo general de este procedimiento es observar la morfología de las vesículas extracelulares purificadas y realizar la localización de proteínas específicas dentro de las vesículas extracelulares mediante microscopía electrónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el período de investigación de las vesículas extracelulares, como la categorización del exosoma y las proteínas específicas ubicadas en su interior. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para observar la porción de proteínas específicas localizadas tanto dentro como fuera del exosoma.

La implicación de esta técnica es asegurar el diagnóstico de varias enfermedades, incluyendo el cáncer y las infecciones bacterianas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el exosoma, también se puede aplicar a otras muestras biológicas, la incubación microcelular y la localización de proteínas específicas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la creación de contaminación mientras se unen de forma no específica a la partícula de inmunooro.

Utilizando técnicas estándar, prepare exosomas en cultivo. A continuación, ultracentrífugo el sobrenadante de cultivo de células HCT116 para granular los exosomas del medio. Una vez granulado, retire con cuidado el sobrenadante de cultivo.

Para fijar el pellet de exosoma purificado, agregue un mililitro de glutaraldehído al 2,5% en una solución de cacodilato de soldium 0,1 molar a PH 7.0. Incubar las vesículas lipídicas durante una hora a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el fijador y enjuague los gránulos con un mililitro de una solución tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, coloque el prefijo de las muestras con un mililitro de tetróxido de osmio al 2% durante una hora a cuatro grados centígrados. Retire el fijador y enjuague el gránulo de exosoma tres veces con el tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar, cambiando el tampón cada diez minutos. A continuación, deshidrate la muestra agitándola durante 10 minutos cada una en una serie de concentraciones graduadas de acetona.

A continuación, mezcle una solución de tres partes de acetona y una parte de mezcla de inclusión de baja viscosidad. Reemplace la acetona con esta mezcla e incube la muestra durante 30 minutos. Continúe aumentando la proporción del medio de inclusión de baja viscosidad, incubando durante 30 minutos con cada paso.

Finalmente, incube el pellet de exosoma en el 100% de la mezcla de inclusión de baja viscosidad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, incruste la muestra en una mezcla de inclusión pura de baja viscosidad utilizando un molde de inclusión y hornee durante 24 horas a 65 grados centígrados. Usando un ultramicrótomo, prepare secciones con un grosor de 60 nanómetros.

Coloque las secciones en una rejilla de níquel y tiña dos veces algunas de ellas con acetato de uranilo al 2% durante 20 minutos, seguido de citrato de plomo durante 10 minutos. A continuación, coloque la sección teñida en un microscopio electrónico de transmisión y observe la muestra utilizando 80 kilovoltios y siga los ajustes automáticos del tiempo de exposición. Con una imagen de exosoma a la vista, adquiera y guarde la imagen utilizando el software del microscopio.

Para empezar, incube rejillas que contengan secciones sin teñir de 60 nanómetros de grosor en gotas de 50 microlitros de glicina 0,02 molar durante 10 minutos para apagar los grupos aldehídos libres. Luego, enjuague las secciones en 100 microlitros de agua destilada tres veces durante 10 minutos cada una. Después del último enjuague, incubar las secciones durante una hora a temperatura ambiente en PBS que contenga 1% de BSA.

A continuación, incube las rejillas en gotas de 50 a 100 microlitros de un anticuerpo anti-KRS durante una hora. A continuación, lave las rejillas cinco veces durante 10 minutos cada una con una gota de PBS que contenga 0,1% de BSA. A continuación, transfiera las rejillas a una gota de un anticuerpo secundario adecuado e incube las secciones durante una hora a temperatura ambiente.

Ahora, lave las rejillas cinco veces durante 10 minutos, cada una con una gota separada de PBS que contiene 0.1% BSA. Tiñe dos veces las secciones con acetato de uranilo al 2% durante 20 minutos en la oscuridad, seguido de citrato de plomo de Reynolds durante 10 minutos. Coloque la sección teñida en un microscopio electrónico de transmisión y observe la muestra usando 80 kilovoltios y obtenga imágenes de ellas como se muestra anteriormente.

Para realizar la tinción negativa, fije los exosomas purificados después del aislamiento con un mililitro de paraformaldehído al 2% durante cinco minutos. Trate rejillas EM delgadas, recubiertas de película de formvar/carbono, de 200 mallas, de cobre con descarga incandescente durante un minuto, luego cargue de cinco a siete microlitros de la solución de suspensión de exosomas en una rejilla e incube durante un minuto. Si la concentración de exosoma es demasiado alta, diluya la concentración a un nivel adecuado.

Tiñe inmediatamente los exosomas con unas 20 gotas de una solución filtrada de acetato de uranilo al 1% en la superficie de la rejilla EM. Retire el exceso de solución de acetato de uranilo de la rejilla contactando el borde de la rejilla con papel de filtro, luego enjuague rápidamente la rejilla con una gota de agua. Use un par de pinzas para colocar la rejilla sobre la mesa y cubra la rejilla parcialmente con un plato de cultivo.

Deje que la rejilla se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego obtenga una imagen de la rejilla o guárdela en una caja de rejilla de microscopio electrónico para futuras observaciones. Comience por tratar las rejillas EM de cobre de malla 200 recubiertas con una fina película de formvar/carbono con descarga incandescente durante 30 segundos. A continuación, cargue de cinco a siete microlitros de los exosomas fijados en una solución de paraformaldehído al 2% en la rejilla e incube allí durante cinco minutos.

A continuación, enjuague los exosomas con 100 microlitros de PBS, tres veces cada una durante 10 minutos. Trate las rejillas que contienen exosomas con 50 microlitros de una solución de glicina 0,5 molar durante 10 minutos para apagar los grupos aldehídos libres. Luego, transfiera las cuadrículas a una gota de PBS que contenga 1%BSA y bloquee durante 30 minutos.

Ahora incube las rejillas con 50 a 100 microlitros de anticuerpo anti-PD-L1 durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Lave la rejilla con cinco gotas separadas de PBS que contengan 0,1 % de BSA durante 10 minutos cada una, luego transfiera la rejilla a una gota del anticuerpo secundario durante una hora. A continuación, lave la rejilla con cinco gotas separadas de PBS que contengan 0.1%BSA durante 10 minutos cada una, luego lave la rejilla con dos gotas separadas de agua destilada.

Cuando termine, realice la tinción negativa con acetato de uranilo al 2%, como se mostró anteriormente, y tome imágenes de las muestras, o guárdelas en una caja de rejilla EM para futuras observaciones. La morfología del exosoma observada aquí es producto de una tinción negativa. Estos exosomas muestran una morfología típica en forma de copa, que es un artefacto que puede ocurrir durante el proceso de secado.

Se puede obtener información adicional utilizando la tinción de inmunogold de montaje completo, como la ubicación de proteínas específicas en el exosoma. Aquí, las flechas blancas indican la ubicación de PD-L1. En las imágenes seccionadas, las vesículas mostraron una estructura lumínica que se conoce como una característica estructural de los exosomas.

Estos también se pueden teñir con inmunooro para identificar proteínas específicas a lo largo de los exosomas. Una vez dominada, la técnica de tinción con inmunogold puede realizarse en células fibrosas siguiendo una sencilla preparación y seccionamiento si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la doble inmunotinción para identificar simultáneamente la ubicación de dos proteínas diferentes.

Después de cada desarrollo, esta técnica se puede utilizar en el campo de las vesículas extracelulares para explorar el diagnóstico de enfermedades en biopsias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar la localización de proteínas específicas dentro del exosoma. No olvide que están trabajando con soluciones fijadoras, como el clorhidrato, el paraformaldehído y el tetróxido de osmio, que pueden ser extremadamente peligrosas y siempre se deben tomar precauciones como la campana extractora ventilada y los guantes de látex al realizar este procedimiento.