Análisis de la función de células satelitales durante la regeneración muscular esquelética por lesión de cardiotoxina e inyección de siRNA autoentregado In Vivo

Esta técnica permite la combinación de la inyección intramuscular del veneno de serpiente cardiotoxina, la inyección intramuscular de siRNA auto-entrega, permitiendo así el análisis de la regeneración del músculo esquelético. La aplicación del siRNA auto-entrega es una manera elegante de investigar la pérdida funcional de genes individuales durante la regeneración muscular, evitando así animales transgénicos. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, afeite el área de inyección de la pierna inferior craneal desde la rodilla hasta la pata, y retire cualquier cabello suelto.

Coloque el ratón en la condición supina en una almohadilla de dirección cubierta con un paño quirúrgico estéril, y utilice 70%etanol para desinfectar el área de inyección de la pierna inferior craneal. A continuación, cargue una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 29, con 50 microlitros de 20 cardiotoxinas micromolares y perfore la piel completamente en el músculo, sólo distal a la rodilla. Cuando la aguja está en su lugar, inyectar la cardiotoxina durante un período de entrega de 10 a 20 segundos a lo largo de toda la longitud del músculo, mientras se mueve la aguja hacia adelante y hacia atrás, para permitir una distribución uniforme de la cardiotoxina, lesionando así todo el músculo tibialis anterior.

A continuación, vuelva a colocar el ratón en su jaula en una almohadilla de calentamiento con supervisión hasta la recumbencia completa. Tres días después de la cirugía, desinfecte el área de inyección como se acaba de demostrar. Inyectar hasta 50 microlitros de siRNA dirigidos contra el gen objetivo de interés en el músculo anterior tibialis del ratón anestesiado, como se acaba de demostrar.

A continuación, vuelva el ratón a su jaula, con supervisión hasta la recumbencia completa. Antes de recoger el tejido muscular lesionado, envuelva la lámina alrededor de un lápiz y selle el lápiz con cinta adhesiva, de manera que la parte inferior del molde proporcione una superficie uniforme y cerrada. Cuando el moho esté listo, desinfecte todo el animal con 70%etanol, y use tijeras extra afiladas para quitar la piel del tobillo.

Antes de cosechar el músculo, utilice fórceps finos para pellizcar los fórceps cerrados a través de la fascia junto al hueso de la tibia en el tobillo de la pierna lesionada, y mover los fórceps hacia la rodilla para romper la fascia, exponiendo el músculo tibialis anterior. Para aislar el músculo anterior tibialis, exponer el tendón distal, y agarrar el tendón con fórceps finos. Utilice tijeras de resorte para cortar el tendón, y agarre el músculo en el tendón para tirar del músculo hacia la rodilla.

Para permitir el análisis de la región de vientre medio, utilice tijeras rectas para cortar el músculo anterior tibialis en la región del vientre medio en dos mitades del mismo tamaño, y llene el molde de lápiz hasta la mitad con solución de congelación. Inserte las dos mitades del músculo anterior tibialis en el molde de congelación en posición vertical, con la región de vientre medio mirando hacia la parte inferior del molde. Utilice fórceps para transferir el molde de congelación hasta la mitad en nitrógeno líquido.

Cuando el medio de congelación cambie de transparente a blanco y se vuelva sólido, transfiera el molde de congelación a un congelador Celsius de 80 grados, o al hielo seco para su procesamiento futuro. En los músculos de control, la arquitectura del tejido permanece intacta, como se observa por la localización de los núcleos en la periferia de los miofiberes, y la falta de acumulación de células mononucleadas dentro del espacio intersticial. Siete días después de la lesión mediada por cardiotoxinas, se forman nuevos miofiberes marcados por núcleos localizados centralmente, y una acumulación de células mononucleadas que consisten principalmente en células satélite, pero también células no miogénicas como las células inmunitarias.

En condiciones de reposo, las células satélite marcadas por la tinción Pax7 en rojo, se encuentran debajo de la lámina basal, que se muestra en verde aquí. Tres días después de la lesión, el número de células satélite aumenta, y las células satélite ya no se encuentran debajo de la lámina basal. En el día 10 después de la lesión, el número de satélites sigue aumentando.

Para analizar más a fondo el proceso de regeneración, las miofibras recién formadas se pueden teñir con anticuerpos dirigidos contra la miosina del desarrollo. Dos días después de la inyección con siRNA, las células satélite se pueden analizar para detectar la presencia del ARNrN con la etiqueta fluorescente. En este experimento representativo, alrededor del 75% de las células satélite del músculo regenerador fueron positivas para el siRNA con etiqueta fluorescente.

Además, alrededor del 74% de todas las miofibras regeneradoras también fueron positivas para el siRNA con la etiqueta fluorescente, lo que sugiere que o bien el 74% de los miofibers regeneradores tomaron el siRNA, que las células satélite siRNA positivas se habían fusionado para formar nuevos miofibers, o que se había producido una fusión con miofibers regeneradores ya existentes. El paso más crítico es lograr una lesión completa del músculo anterior tibialis. Además del análisis histológico, se pueden registrar parámetros como la fuerza generada para analizar la regeneración del músculo esquelético de manera funcional.