Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada
17 de enero de 2020
Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.
Nuestro método es significativo, ya que permite al bioquímico promedio determinar rápidamente si las muestras aisladas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas están contaminadas con metales de transición. La principal ventaja es la facilidad con la que se puede realizar el ensayo. El ensayo utiliza instrumentación y técnicas comunes a la mayoría de los laboratorios de bioquímica, y se puede implementar fácil y rápidamente.
Mientras que en este artículo aplicamos este método para muestras aisladas con una columna de níquel-NTA, el método se puede utilizar con cualquier otra resina de afinidad de metal. Los usuarios por primera vez deben probar este método con una solución de material de níquel de concentración conocida. Esto los familiarizará con el flujo de trabajo, los colores de la muestra y las resinas que se muestran en los cambios espectrales.
Demostrando el procedimiento estará Cole Swain, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, encienda y caliente el espectrofotómetro UV-Vis. Determinar las fracciones de cromatografía a ensayo utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos con absorbancia óptica a 280 nanómetros para cuantificar la proteína.
Obtenga de 10 a 100 tampón de muestra milimiolar con un PH entre 7 y 12, como Tris, HEPES, MOPS y tampón de fosfato. Preparar una solución de 12% de peso por volumen de dispersión de HNB en el tampón de muestra utilizando 120 miligramos de reactivo HNB para cada mililitro de solución de stock preparado. Establezca el espectrofotómetro para recopilar datos en 647 nanómetros.
Utilice una cubeta de cuarzo llena con el búfer de muestra para dejar en blanco el espectrofotómetro. Preparar una solución de control en una cubeta que contenga 50 microlitros de HNB por mililitro del volumen total del ensayo. Deje que el control se incuba durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.
Mida y registre la absorbancia en 647 nanómetros para la muestra de control. Prepare las muestras de ensayo mezclando 150 microlitros de caldo HNB con 2850 microlitros de fracciones de proteínas adecuadamente diluidas con el tampón de muestra. Dejar incubar la muestra durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.
Repita la grabación de espectro para cada fracción a medir. En el caso de que no se obtenga suficiente dilución, toda la banda espectral a 647 nanómetros ha desaparecido. Mientras que con una dilución demasiado fuerte, la muestra es indistinguible del control.
Para determinar la concentración de metal en cada muestra, primero encuentre la diferencia de cada absorbancia de muestra a 647 nanómetros del control HNB. Determinar la concentración de metal en micromolar utilizando la fórmula donde el DF es el factor de dilución para la fracción de ensayo, delta A-B-S 647 es el cambio de absorbancia a 647 nanómetros, 3.65 veces 10 a la negativa 2 representa el coeficiente de extinción de HNB, y l es la trayectoria óptica de la cuvette en centímetros. En este estudio, aquí se muestra el espectro de HNB libre en PH neutro en espectros representativos de fracciones ensayadas para ion de níquel del aislamiento de MSP1E3D1.
Se observó una disminución de la absorbancia en 647 nanómetros en comparación con el control HNB, que correspondía a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Para demostrar la aplicación de este ensayo, se analizaron dos proteínas de andamios de membrana etiquetadas, MSP1E3D1, MSP2N2, y un novedoso citocromo de tipo C de tres hemo, de geobacter sulfurreducens. El contenido de iones de proteína y níquel de cada fracción para GSU0105 se desplazó significativamente entre sí, mientras que las fracciones para MSP1E3D1 y MSP2N2 que contenían la mayor cantidad de proteína también tenían el mayor contenido de níquel.
También se ilustra que el contenido del metal puede no distribuirse uniformemente entre las fracciones recogidas mediante una cromatografía de afinidad de metal movilizada. Es más importante mezclar adecuadamente y consistentemente el espacio en blanco en todas las muestras y permitir tiempos de incubación iguales para el espacio en blanco en todas las muestras. Las fracciones proteicas de especial interés podrían analizarse más a fondo con espectrometría de absorción atómica o ICPMS para confirmar la contaminación por metales y probar iones metálicos proteicos quelados o fuertemente unidos.
Además de la detección de lixiviación de metales de transición, esta técnica se puede utilizar para medir las afines de unión en iones metálicos de transición a proteínas. HNB y cualquier níquel presente en las muestras son irritantes para los ojos y la piel respectivamente. Durante el método se debe utilizar EPI estándar, incluidos guantes y protección para los ojos.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un ensayo sencillo para cuantificar metales en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. El método emplea azul de hidroxinaftol como indicador colorimétr游戏副本 y utiliza un espectrofotómetro UV-Vis para la detección.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- química analítica
- cromatografía de afinidad metálica
Antecedentes
- La contaminación de las muestras con metales de transición puede afectar los resultados experimentales.
- La cromatografía de afinidad con metales inmovilizados es una técnica común en bioquímica.
- Los métodos existentes para detectar la contaminación por metales pueden ser complejos o requerir equipos especializados.
- Se necesita un método sencillo y accesible para el análisis de rutina en laboratorios de bioquímica.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un ensayo sencillo para detectar contaminación por metales en muestras.
- Permitir a los bioquímicos evaluar rápidamente la pureza de las muestras.
- Facilitar el uso de equipos de laboratorio comunes para la cuantificación de metales.
Métodos Utilizados
- Uso del hidroxinaftol azul como indicador colorimétrico.
- Aplicación de espectrofotometría UV-Vis para la detección.
- Pruebas con columnas de níquel-NTA y otras resinas de afinidad metálica.
- Ensayos iniciales con concentraciones conocidas de soluciones patrón de níquel.
Resultados principales
- El ensayo permite una evaluación rápida de la contaminación por metales.
- Los resultados se pueden obtener utilizando técnicas de laboratorio estándar.
- El método es adaptable a diversas resinas de afinidad metálica.
- Los usuarios pueden familiarizarse con el flujo de trabajo mediante ensayos iniciales.
Conclusiones
- El ensayo propuesto simplifica la detección de contaminación por metales.
- Es accesible para bioquímicos promedio utilizando equipo de laboratorio común.
- El método mejora la fiabilidad de las muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad por metales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La lixiviación de metales a partir de columnas de cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC) introduce contaminantes de metales de transición que pueden inhibir la actividad enzimática y comprometer la fiabilidad del ensayo en la investigación y desarrollo de biofármacos. Este protocolo proporciona un método sencillo y accesible para cuantificar dicha contaminación mediante espectrofotometría UV-Vis, ampliamente disponible, y azul de hidroxinaftol (HNB), lo que permite un control de calidad rutinario sin necesidad de instrumentación especializada. Al ofrecer sensibilidad en el rango nanomolar con equipos de laboratorio estándar, el ensayo contribuye a la integridad de los datos en procesos de validación inicial de dianas y de purificación de proteínas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar si la inhibición enzimática observada se debe a la biología del blanco o a la contaminación por metales, reduciendo los falsos positivos en la validación del blanco.
- Valor operativo: Utiliza espectrofotómetros UV-Vis existentes y tampones comunes, permitiendo una implementación rápida en diversos equipos de descubrimiento sin necesidad de invertir en nuevos equipos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas de iones metálicos a 647 nm, permitiendo la correlación entre los niveles de lixiviación y la pureza de la fracción en la purificación por IMAC.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación de contaminación entre variantes proteicas y resinas, facilitando el desarrollo de ensayos reproducibles para la producción de proteínas con etiqueta his.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Confirma el estado libre de metales de las proteínas purificadas antes de los ensayos funcionales, mejorando la confianza predictiva en estudios posteriores de interacción con el objetivo.
- Valor operativo: Proporciona un criterio de liberación para los lotes de proteínas, permitiendo tomar decisiones de avance o detención antes de comprometerse con pruebas preclínicas de eficacia.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se sitúa entre la purificación por IMAC y la caracterización bioquímica o biofísica posterior, sirviendo como un punto de control para la pureza de la muestra antes de los estudios de cinética enzimática, ensayos de unión o estudios estructurales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al descartar artefactos mediados por metales en los datos de actividad enzimática o interacciones proteicas.
- Tamizaje: Garantiza la idoneidad del ensayo al verificar que las fracciones proteicas purificadas estén libres de metales de transición inhibidores que podrían sesgar los resultados del tamizaje de compuestos.
- Análisis: Genera valores cuantitativos de cambio de absorbancia a 647 nm, permitiendo el cálculo de concentraciones micromolares de metales para comparaciones entre lotes.
- Investigación Traducional: Conecta la calidad de la purificación con la continuidad preclínica al asegurar que la contaminación por metales no altere la validación del blanco ni las mediciones de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como un paso de control de calidad reutilizable aplicable a cualquier purificación basada en IMAC, independientemente del tipo de resina o proteína diana.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al eliminar una fuente común de ruido bioquímico en los ensayos enzimáticos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante un método colorimétrico con parámetros definidos de incubación y medición.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de experimentos fallidos debido a la inhibición no detectada por metales, mejorando la eficiencia del capital en campañas de identificación de compuestos activos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos proteicos basada en la pureza confirmada, apoyando una mejor asignación de recursos en la fase temprana del descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere familiaridad con la espectrofotometría UV-Vis y la preparación básica de soluciones para el reactivo HNB.
- Depende del acceso a cubetas de cuarzo y un espectrofotómetro capaz de realizar mediciones de absorbancia a 647 nm.
- Necesita una dilución de muestras y tiempos de incubación consistentes para garantizar cálculos precisos de delta-AB.
- Puede requerir optimización para proteínas con absorbancia intrínseca intensa o interferencia de color a 647 nm.
- Se combina mejor con métodos ortogonales como AAS o ICPMS para confirmación cuando se necesita una cuantificación confiable de metales.
