Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Les protocoles de différenciation des cellules souches en cellules rénales fonctionnelles restent insaisissables. Cette méthode produit des podocytes matures avec spécificité et efficacité, fournissant de nouveaux outils pour l’étude des mécanismes des maladies rénales. Cette méthode utilise un milieu de culture cellulaire et des protéines de matrice extracellulaire avec une composition chimiquement définie pour produire des podocytes dérivés de cellules iPS humaines d’une grande pureté sans utiliser de sélection de sous-population ou de manipulation génétique.

Les options thérapeutiques pour les patients atteints d’insuffisance rénale sont limitées. Cette méthode a des implications pour la modélisation et la compréhension des mécanismes de la maladie, ce qui pourrait faciliter le développement de nouveaux biomarqueurs et traitements. Pour mettre en place une culture humaine d’iPSC sans nourrisseur, aspirez la solution résiduelle de la matrice de membrane basale 1 à partir de plaques pré-enduites et lavez les puits trois fois avec un à deux millilitres par puits de milieu basal chauffé.

Aspirez le milieu de culture cellulaire usagé d’une culture iPSC humaine et rincez les cellules trois fois avec un milieu réchauffé. Ajouter un millilitre de solution chaude de détachement cellulaire dans chaque puits pour une incubation d’une minute à 37 degrés Celsius. Après avoir confirmé les bords arrondis de la colonie cellulaire au microscope de culture tissulaire, aspirez rapidement la solution de décollement cellulaire et rincez doucement les cellules avec un milieu de culture cellulaire.

Ajoutez trois millilitres de milieu de culture iPSC humain aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme et utilisez un élévateur de cellules pour gratter les colonies. Pipetez doucement la suspension cellulaire pour déloger les cellules qui adhèrent lâchement et lavez soigneusement la plaque pour assurer la récolte de toutes les cellules. Transférez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une nouvelle matrice de membrane basale, 1 plaque à six puits revêtue contenant deux millilitres de cellules souches pluripotentes induites par l’homme par puits et déplacez la plaque en huit pour répartir uniformément les colonies cellulaires dans les puits.

Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en rafraîchissant le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 70 % de confluence. Si nécessaire, gratter aseptiquement les zones de différenciation avant d’aspirer le surnageant des puits. Après avoir lavé les puits trois fois, dissociez les cellules comme démontré et tirez les suspensions cellulaires résultantes dans un tube conique de 15 millilitres.

Après le mélange par pipetage, porter le volume final dans le tube à 15 millilitres avec un milieu chaud et recueillir les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu frais pour une deuxième centrifugation et mettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu d’induction du mésoderme pour le comptage. Après le comptage, remettez les cellules en suspension à une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de concentration de milieu d’induction du mésoderme et aspirez la solution de matrice extracellulaire de la matrice de membrane basale 2 plaques revêtues.

Rincez les plaques deux fois avec un milieu chaud et mélangez la suspension de cellules souches pluripotentes induite par l’homme avec un pipetage doux. Ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits de la matrice de la membrane basale, 2 plaques revêtues de 12 puits et secouez doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

Aux jours 2 à 15 de la différenciation, remplacez le milieu d’induction du mésoderme par un millilitre de milieu d’induction du mésoderme intermédiaire par puits. Si une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments sont observés, comme l’indique le jaunissement du milieu, le volume du milieu de différenciation intermédiaire du mésoderme peut être augmenté à 1,3 millilitre par puits. Au 16e jour de la culture, rincez les cellules intermédiaires du mésoderme avec un milieu chaud et incubez les cellules avec 500 microlitres de 0,05 % de trypsine EDTA par puits pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules commencent à se dissocier, grattez les cellules avec un lève-cellules et mélangez doucement les cellules par pipetage. Arrêtez la réaction avec environ deux millilitres de solution neutralisante de trypsine par puits et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Portez le volume à 50 millilitres avec un fluide et récupérez les cellules par centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans un milieu d’induction de podocytes à une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de concentration de milieu et ajoutez les cellules à la matrice de membrane basale 2 plaques revêtues. Ensuite, secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément et placez les cellules dans l’incubateur jusqu’à cinq jours. En utilisant la stratégie de culture démontrée, les cellules souches peuvent d’abord être différenciées en cellules mésodermiques qui expriment Brachyury, puis différenciées en cellules intermédiaires du mésoderme PAX2 positives, et finalement en podocytes glomérulaires rénaux matures.

Les podocytes dérivés de cellules souches se colorent pour WT1, ainsi que pour la néphrine, marqueur d’identification de la lignée. Curieusement, la localisation subcellulaire de la néphrine se fait principalement dans les processus du pied podocytaire et le cytoplasme cellulaire, ce qui correspond à un phénotype de podocytes matures. Les cellules ensemencées à des densités qui dépassent significativement la densité recommandée de un fois 10 à la cinquième cellule par puits d’une plaque de 12 puits produisent de grands amas de cellules qui n’ont pas le phénotype morphologique attendu des podocytes matures dans la chronologie standard du protocole.

L’ensemencement aux densités recommandées dans ce protocole permet cependant d’obtenir des cultures de cellules ayant la morphologie souhaitée. Nous recommandons d’utiliser la protéine de la membrane basale appropriée pour le détachement cellulaire et de maintenir la densité d’ensemencement cellulaire correcte pour l’induction du mésoderme et des podocytes. Cette méthode de différenciation des podocytes peut être intégrée à des systèmes microfluidiques d’organes sur puce ou à des technologies de bio-impression 3D pour développer des modèles fonctionnels du rein humain pour le dépistage de médicaments et les tests de néphrotoxicité.

Le manque de modèles de culture cellulaire appropriés a entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes des maladies rénales. Ce protocole fournit aux chercheurs une source inépuisable de podocytes dérivés de patients pour la modélisation de la maladie.