Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

La microdisección láser permite el análisis transcriptómico de regiones espacialmente definidas dentro de las muestras de tejido renal. Esto nos brinda la oportunidad única de identificar estructuras de interés incluso después de que se produjeran cambios inducidos por la enfermedad. Las principales ventajas de esta metodología son su complementariedad con otras tecnologías ómicas, como la secuenciación de ARN unicelular.

Ofrece una notable economía de tejidos e incluso permite la detección de transcripciones de baja expresión. Después de adquirir la muestra de tejido, use un criostato configurado a menos 20 grados Celsius para cortar la muestra a un grosor de 12 micrómetros y use el adaptador de portaobjetos para fijar la muestra a un portaobjetos de microdisección láser especializado. Dentro de los 10 días posteriores a la criosección, mezcle 89,2 microlitros de 10% BSA libre de ARNasa en PBS con cuatro microlitros de faloidina FITC, 1,5 microlitros de DAPI, dos microlitros del anticuerpo de interés conjugado directamente con Alexa Fluor 546 y 3,3 microlitros de inhibidor de RNasa.

Lave el portaobjetos a menos 20 grados centígrados con acetona al 100% durante un minuto y colóquelo en una cámara de humedad. Lave la parte superior del portaobjetos dos veces con PBS fresco sin RNasa durante 30 segundos por lavado, seguido de dos lavados de 30 segundos con 10% de BSA en PBS sin RNasa. Después del último lavado, trate la muestra con la solución de anticuerpos preparada durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de lavar dos veces más con 10% de BSA en PBS libre de ARNasa.

Después del segundo lavado, seque al aire el portaobjetos durante cinco minutos en una campana de cultivo de tejidos antes de cargar el portaobjetos en la plataforma de corte de microdisección láser. Instale en el dispositivo tubos colectores de microcentrífuga de 500 microlitros esterilizados en autoclave, apropiados para el trabajo de PCR, que contengan 50 microlitros de tampón de extracción de un kit de aislamiento de ARN. Después de cargar, identifique las regiones de interés dentro de la muestra por tinción, morfología y ubicación.

Utilice la inmunofluorescencia para delinear al menos 500.000 micrómetros cuadrados de segmentos cuadrados de interés. A continuación, inicie la microdisección láser para extirpar la región utilizando una potencia láser superior a 40. Una vez finalizado el proceso de microdisección láser, tape los tubos de recolección de la microcentrífuga y agite los tubos vigorosamente para asegurarse de que el contenido se mueva de las tapas a la parte inferior de los tubos.

Después de la centrifugación, incube los tubos en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 30 minutos antes de volver a centrifugar los tubos. Luego transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de 500 microlitros desde el almacenamiento a menos 80 grados Celsius. La identificación de subsegmentos tubulares en el riñón se logra a través de la tinción de anticuerpos de marcadores tubulares únicos, además de la morfología celular y los puntos de referencia estructurales.

El marcaje de fluorescencia junto con las características morfológicas del tejido y el posicionamiento espacial de las estructuras de la imagen facilita la visualización de los subsegmentos renales con un alto grado de confianza. En este análisis representativo de secuenciación posterior, la tasa de éxito de cumplir con la entrada mínima de área de disección fue superior al 90%, lo que resultó en una alta cantidad total de ARNm disponible para la detección de genes. En este análisis, el 100% de las muestras cumplieron el umbral mínimo de detección de al menos 10.000 genes.

Después de la microdisección láser, el análisis de enriquecimiento de la expresión génica de marcadores conocidos se puede comparar con los de otros compartimentos. En este análisis, se identificó un marcador para cada subsegmento mediante transcriptómica regional de microdisección láser que también produjo una tinción inmunohistoquímica específica del subsegmento de nefrona correspondiente. Es importante tener en cuenta que la microdisección láser depende en gran medida de la experiencia del usuario para identificar con precisión las estructuras de interés que se van a diseccionar.

Esta técnica permite el estudio de firmas regionales específicas de expresión génica que se pueden utilizar para evaluar las posibles vías implicadas en la progresión de la enfermedad, así como la biología del tejido sano.