Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

A continuación, proporcionamos una descripción detallada de la microdisección láser aplicada para lograr un perfilado comparado de transcritos de ARN de zonas silenciadas y no silenciadas del disco alar de Drosophila. Este enfoque requiere como material biológico discos imaginales de Drosophila diseccionados manualmente y como equipo principal un microdisector láser. Utilizamos el LI A-L-L-M-D 6,000 y una máquina de PCR en tiempo real.

Utilizamos un BioRad iq. Las cinco herramientas pequeñas necesarias son una placa cóncava, un pincel pequeño, pinzas para microdisección, portaobjetos para gota colgante, pines para insectos montados en agujas de jeringa, un marco metálico con membrana de PET y tubos plásticos pequeños. Este método comprende los siguientes pasos.

Paso uno: cruzar dos líneas transgénicas oph adecuadas para inducir un silenciamiento génico localizado y específico en la descendencia, haciendo uso del sistema GAL cuatro UAS. Paso dos: tratar los marcos de disección. Paso tres: preparar el microdiseccionador láser.

Paso cuatro, recolectar manualmente los discos imaginarios de alas de la progenie larval del cruce genético. Paso cinco, realizar la microdisección láser de áreas específicas de los discos imaginarios marcados con GFP. Paso seis, el perfilado de la transcripción de áreas equivalentes de regiones silenciadas y no silenciadas del disco permitirá establecer los efectos provocados por el silenciamiento del gen de interés.

La caracterización de la transcripción in vivo del gen X requerirá la extracción de ARN a partir de las áreas microdiseccionadas, el control de la precisión del diseccionado manual, la evaluación de la expresión de GFP en las dos muestras mediante R-T-P-C-R, y la cuantificación de la expresión de los posibles objetivos del gen silenciado en las dos muestras mediante R-T-P-C-R en tiempo real o mediante un análisis de microarreglo. Ahora, más detalles sobre cada paso.

El primer paso, el cruce genético. El cruce genético implica cepas transgénicas GAL4-UAS y se centra en obtener discos imaginales silenciados en la progenie larval. El sistema versátil GAL4 permite activar el silenciamiento génico específico y localizado mediante interferencia de ARN.

Una cepa introduce en el cruce el transgén conductor que expresa GAL4 en un patrón temporal o espacial específico, y un marcador A-U-A-S-G-F-P que permite la visualización del dominio de expresión de GAL4. La segunda cepa introduce un transgén regulado por UAS que expresa un ARN de interferencia en forma de horquilla, capaz de dirigirse específicamente al gen X una vez expresado en la célula.

Este ARN se escinde para generar ARN interferente pequeño, capaz de silenciar específicamente el gen X seleccionado en la descendencia de este cruzamiento. El transgén de silenciamiento bajo control de UAS solo se transcribe en aquellas células que expresan la proteína GAL4, induciendo así un silenciamiento espacialmente restringido del gen X. Entre la variedad de aplicaciones, nos centramos en el perfilado de transcritos de ARN en el disco alar silenciado mediante el conductor GAL4 Grailed, que dirige un silenciamiento específico en el compartimento posterior.

La región silenciada se marca mediante la expresión del transgén U-A-S-G-F-P. En el compartimento posterior. Se activarán dos eventos: la expresión de GGFP y el silenciamiento del gen x.

Paso dos, tratamiento de los marcos de disección para inhibir la actividad de las RNasas. Lave las láminas portaobjetos y las herramientas de disección con agua DEPC durante al menos una hora a temperatura ambiente y déjelas secar en una cámara estéril. Para inhibir la actividad de las RNasas, utilice un tubo nuevo de 50 ml ya libre de RNasas, lleno con agua DEPC, en el que coloque con pinzas las herramientas, una lámina con gota colgante y un marco para portaobjetos.

Ambos necesarios para la microdisección. Cierre el tubo, inviértalo boca abajo y déjelo reaccionar durante al menos una hora. A temperatura ambiente, una hora después, transfiera el agua DEPC a otro tubo con las pinzas.

Sostenga los portaobjetos dentro del tubo para que no caigan. Luego deje secar los portaobjetos dentro del tubo. Paso tres, configuración de microdisección.

En primer lugar, encienda todos los dispositivos necesarios: la lámpara de fluorescencia, el microscopio y el software para la microdisección. Una ventana de advertencia le recordará que también debe encender el láser. Hágalo y permita que el láser se caliente mientras finaliza la configuración de la microdisección.

Ahora es el momento de preparar los pocillos en los que se recopilará el tejido cortado. El equipo de corte láser Leica LMD 6,000 permite cargar hasta cuatro tubos para recopilar diferentes muestras. Para nuestro propósito, necesitamos solo dos tubos.

Uno, para recolectar el tejido silencioso positivo para GFP; el otro, para recolectar el tejido unilátero negativo para GFP con un micro pinceta. Llene ambos tapones de tubo con 20 microlitros de solución de reactivo tri para preservar el ARN. Ahora el microdisector está listo para usar. Paso cuatro: disección manual de discos de imagenación alares de larvas joof.

Aislar los discos alares de la progenie larval obtenida como se describió previamente, y asegurarse de que otros tejidos no contaminen los discos. Para lograr este objetivo, el enfoque de disección es bastante diferente del que se usa comúnmente para recolectar la mayor parte de todos los discos originales. Primero, lavar la larva en solución de Ringer para eliminar el medio adherido. Luego, transferirla a una preparación de gota colgante y cortar la cabeza inmediatamente, jalando hacia abajo la boca.

Utilizando las agujas para insectos, diseque ahora cuidadosamente los demás tejidos. El contorno rojo muestra los discos imaginales de las alas que deben recolectarse. Mantenga los discos libres de tejido adherido de forma rápida y suave. Transfiera cada disco alar aislado a un portaobjetos para disección para su corte inmediato.

Este procedimiento debe repetirse hasta alcanzar un número total de cien discos alares. Paso cinco, microdisección láser de áreas específicas de discos alares marcados con GFP. Una vez que el disco alar original esté sobre la membrana, puede proceder con el corte.

Coloque el portaobjetos en su soporte y fije el soporte en la platina motorizada. Busque el disco alar original utilizando el LMD 6,000 como microscopio común. Enfóquelo y configure el corte.

Dibuje un área ovalada que se ajuste a ambos lados del disco, el positivo para GFP y el otro. Seleccione la tapa del tubo donde desea recolectar la parte positiva para GFP. Presione el botón Iniciar corte.

El microdiseccionador continúa cortando el tejido con la velocidad y potencia que estableció anteriormente mediante la selección de la función mover y cortar. Puede ajustar manualmente el corte hasta que caiga el fragmento de tejido no seleccionado. La animación 3D muestra lo que sucede bajo el microdiseccionador: un láser se enfoca en el tejido realizando un corte a lo largo del perímetro seleccionado.

Una vez realizada la incisión, el fragmento de tejido cae en la tapa del tubo seleccionada y, consecuentemente, en el tri Reagente. Después de la primera incisión, desplace el área de corte al otro lado del disco alar para cortar una región equivalente negativa para GFP. Antes de realizar un nuevo corte, asegúrese de seleccionar una tapa de tubo diferente para mantener separados los tejidos positivos para GFP de los negativos para GFP.

Pulse el botón de corte inicial después del corte automático. Proceda a perfeccionar el corte manualmente según lo muestra la animación 3D antes del segundo corte. La platina motorizada mueve la tapa del tubo seleccionada bajo el área de corte.

El haz láser se enfoca en el tejido cortado a lo largo del perímetro seleccionado, y una vez realizado el corte, el fragmento de tejido cae en la tapa de tubo seleccionada que contiene el reactivo Tri. Para recolectar suficiente material, repetimos el procedimiento en cien discos alares imaginales. Una vez que haya recolectado las muestras, retire los tubos.

Este es un paso delicado que puede hacer que pierda todo el trabajo realizado hasta ahora. Así que tenga cuidado. Cierre la tapa boca abajo y continúe con el experimento.

Este es el que presenta tejido positivo para GFP. Este es el otro con tejido negativo para GFP. Paso seis, perfilado de transcripción.

Centrifugar los tubos para separar el líquido de la tapa y agregar reactivo Try hasta un mililitro. Realizar la extracción de ARN siguiendo el protocolo estándar del reactivo Try a partir de cien áreas de aproximadamente 5.000 micrómetros cuadrados cada una. Nuestro rendimiento fue de 1,5 microgramos de ARN.

Utilizamos el marcador tres en vitrógeno para sintetizar ADN con hexámeros aleatorios. La precisión de la disección manual se controló mediante la verificación de la expresión de GFP en las dos muestras por RT-PCR. Como se mostró en el gel con RT-PCR cuantitativa.

Se evaluaron los niveles de expresión del gen silencioso X junto con los de posibles dianas putativas de la vía reguladora mediada por el gen X. Este diagrama muestra un ejemplo de los niveles de expresión del gen X y de uno de sus objetivos putativos. Denomínelos genes Y con respecto a sus niveles de expresión basal en los compartimentos anterior y posterior de los discos alares no solidificados.

Se encontró que la actividad del gen seleccionado X se redujo al 40 % tras el silenciamiento. En contraste, uno de sus posibles blancos, el gen Y, mostró un aumento significativo, siete veces superior, lo que nos llevó a validar la hipótesis de que estaba regulado negativamente por el gen X. Concluimos que el enfoque experimental descrito anteriormente puede aplicarse con éxito para la validación de posibles blancos en diversas vías reguladoras.