Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

En este trabajo proporcionamos una descripción detallada de la microdisección láser aplicada para lograr un perfil de transcripción de ARN comparado A de las áreas silenciadas y no silenciadas del disco del ala de Drosophila. Este enfoque requiere como material biológico, discos de imagen de Drosophila disecados manualmente como equipo principal, un micro disector láser. Utilizamos el LI A-L-L-M-D 6, 000 y una máquina de PCR en tiempo real.

Utilizamos un BioRad iq. Cinco pequeñas herramientas requeridas son una placa cóncava, un pincel pequeño, pinzas de microdisección, colgantes, corredera de caída, pings de insectos, montados en agujas de jeringa, marco de metal con membrana para mascotas, pequeños tubos de plástico. Este método implica los siguientes pasos.

Primer paso: cruzar dos líneas transgénicas OPH adecuadas para desencadenar un silenciamiento génico localizado y específico en la progenie, haciendo uso del sistema GAL four UAS. Paso dos, para tratar los marcos de disección. Paso tres, para configurar el micro disector láser.

Paso cuatro, recolectar manualmente los discos imaginales de las alas de la progenie larvaria del cruce genético. Paso cinco, realizar la microdisección láser de áreas específicas de los discos imaginales marcados con GFP. El sexto paso, el perfil de transcripción de áreas equivalentes de regiones silenciadas y no sólidas del disco, permitirá el establecimiento de los efectos desencadenados por el silenciamiento del gen de interés.

Llámese gen X en vivo el perfil de transcripción requerirá la extracción de ARN de las áreas micro disecadas, el control de la precisión de la disección manual, la evaluación de la expresión de GFP en las dos muestras por R-T-P-C-R, la cuantificación de la expresión de putativo. Dianas del gen del silencio en las dos muestras mediante R-T-P-C-R en tiempo real o mediante la realización de un análisis de microarrays. Ahora más detalles sobre cada paso.

El primer paso, el cruce genético. El cruzamiento genético involucra a GAL, cuatro cepas transgénicas de UAS, y está enfocado a obtener discos imaginales silenciados en la progenie larvaria. El versátil sistema GAL four le permite desencadenar el silenciamiento de genes específicos y localizados por interferencia de ARN.

Una cepa introduce en el cruce el transgén conductor que expresa GAL cuatro en un patrón temporal o espacial específico. Y el reportero A-U-A-S-G-F-P que permite la visualización del dominio de cuatro expresiones GAL. La segunda cepa introduce un transgén de respuesta UAS que expresa ARN silenciador de horquilla, capaz de dirigirse específicamente al gen X una vez expresado en la célula.

Este ARN se escinde para generar un pequeño ARN interferente, que es capaz de silenciar específicamente el gen X seleccionado en la progenie de este cruce. El transgén silenciador de UAS solo se transcribe en aquellas células que expresan la proteína GAL cuatro, induciendo así un silenciamiento espacialmente restringido del gen X. Entre la variedad de aplicaciones, nos centramos en el perfil de transcripción de ARN en el disco del ala silenciado por el controlador GAL cuatro del Grial, que dirige el silenciamiento específico en el compartimento posterior.

La región del silencio está marcada por la expresión del transgén U-A-S-G-F-P. En el compartimento posterior. Dos eventos serán desencadenantes: la expresión de GGFP y el silenciamiento del gen x.

Segundo paso, tratamiento de los marcos de disección para inhibir la actividad de los ARN. Lave los portaobjetos del marco y las herramientas de disección con agua DEPC durante al menos una hora a temperatura ambiente y déjelos secar en una cámara estéril. Para inhibir la actividad de los ARN, utilice un tubo nuevo de 50 ml que ya esté libre de ARN, lleno de agua DEPC con pinzas colocadas en el tubo, un portaobjetos colgante y un marco para mascotas.

Ambos necesarios para la microdisección. Cierre el tubo, déle la vuelta y déjelo reaccionar durante al menos una hora. A temperatura ambiente, una hora más tarde, mueva el agua DEPC a otro tubo con las pinzas.

Sostenga los portaobjetos dentro del tubo para que no se caigan. A continuación, deje que los portaobjetos se sequen dentro del tubo. Paso tres, configuración de microdisección.

En primer lugar, encienda todos los dispositivos necesarios, la bombilla de fluorescencia, el microscopio y el software para la microdisección. Una ventana de advertencia le recordará que debe encender también el láser. Hazlo y deja que el láser se caliente mientras terminas la configuración de la microdisección.

Ahora es el momento de preparar los pozos en los que recoger el tejido. Cortar. El equipo de corte láser Leica LMD 6.000 permite la carga de hasta cuatro tubos para recoger diferentes muestras. Para nuestro propósito, necesitamos solo dos tubos.

Uno, para recoger el tejido de silencio GFP positivo, el otro para recoger el tejido unile negativo de GFP con un micro pectoral. Llene ambos tapones de los tubos con 20 microlitros de solución de tres reactivos para preservar el ARN. Ahora la microdisección está lista para usar Paso cuatro, disección manual de los discos de imágenes de las alas de las larvas de joof.

Aísle los discos de las alas de la progenie larvaria obtenida como se describió anteriormente, y asegúrese de que otros tejidos no contaminen los discos. Para lograr este objetivo, el enfoque de disección es bastante diferente del que se usa comúnmente para recolectar la mayor parte de todos los discos originales. Primero, lave la larva en la solución de ringer para eliminar los medios adheridos. Luego transfiéralo a un tobogán colgante y corte la cabeza inmediatamente tirando de la boca hacia abajo.

Usando los alfileres de insectos, ahora disecciona cuidadosamente otros tejidos. El contorno rojo muestra los discos alares imaginarios que se van a recoger. Mantenga los discos libres del tejido adherido rápida y suavemente Transfiera cada disco de ala aislado a un marco de disección para un corte inmediato.

Este procedimiento debe repetirse hasta que se alcance el número total de cien discos de ala. Paso cinco, microdisección láser de áreas específicas de discos de ala marcados con GFP. Una vez que el disco del ala original esté en la membrana, puede continuar con el corte.

Coloque el marco en su soporte y fije el soporte en la plataforma motorizada. Busque el disco del ala original utilizando el LMD 6, 000 como microscopio común. Concéntrate en ello y establece el corte.

Dibuja un área ovalada que quepa en ambos lados del disco, el GFP positivo y el otro. Seleccione la tapa del tubo donde desea recoger la parte positiva de GFP. Presione el botón Iniciar corte.

El micro disector procede a cortar el tejido con la velocidad y la potencia que establezcas antes seleccionando la función mover y cortar. Puede refinar el corte manualmente hasta que caiga el trozo de tejido no seleccionado. La animación 3D muestra lo que sucede bajo los micros Corte de disector, un láser se enfoca en el tejido haciendo un corte a lo largo del perímetro seleccionado.

Una vez realizado el corte, el trozo de tejido cae en el tapón del tubo seleccionado y, en consecuencia, en el tri reactivo. Después del primer corte, mueva el área de corte en el otro lado del disco del ala para cortar un área negativa de GFP equivalente. Antes de proceder con el nuevo corte, asegúrese de seleccionar una tapa de tubo diferente para mantener separados los tejidos positivos para GFP de los negativos para GFP.

Presione el botón de inicio de corte después del corte automático. Proceda a refinar el corte manualmente como se muestra en la animación 3D antes del segundo corte. La platina motorizada mueve la tapa del tubo seleccionada por debajo del área de corte.

El rayo láser se enfoca en el tejido cortado a lo largo del perímetro seleccionado y, una vez realizado el corte, la pieza de tejido cae en la tapa del tubo seleccionado que contiene el reactivo Tri. Para recoger suficiente material, repetimos el procedimiento en un centenar de discos de alas imaginarios. Una vez que haya recogido las muestras, descargue los tubos.

Este es un paso delicado que puede hacerte perder todo el trabajo que has hecho hasta ahora. Así que ten cuidado. Cierra la tapa al revés y continúa con el experimento.

Este es el que tiene tejido GFP positivo. Este es el otro con tejido GFP negativo. Paso seis, perfilado de transcripción.

Gire los tubos para separar el líquido de la tapa y agregue reactivo Try hasta un mililitro. Realice la extracción de ARN siguiendo el protocolo estándar de reactivos de prueba de cien áreas de aproximadamente 5.000 micrómetros cuadrados cada una. Nuestro rendimiento fue de 1,5 microgramos de ARN.

Utilizamos el superíndice tres en vitrógeno para sintetizar CD NA con hexa aleatoria. La precisión de la disección manual se controló mediante la verificación de la expresión de GFP en las dos muestras mediante R-T-P-C-R. Como se muestra en el gel con R-T-P-C-R cuantitativo.

Evaluamos los niveles de expresión del gen del silencio X junto con los de posibles dianas putativas de la vía reguladora mediada por el gen X. Este diagrama muestra un ejemplo de los niveles de expresión del gen X y uno de sus posibles objetivos. Llámese genes Y con respecto a sus niveles de expresión basal en los compartimentos anteroposteriores de los discos alares no sólidos.

La actividad del gen seleccionado X se encontró reducida al 40% tras el silenciamiento. Por el contrario, uno de sus supuestos objetivos, el gen Y, se encontró significativamente regulado al alza en siete veces, lo que nos lleva a validar la hipótesis de que fue regulado negativamente por el gen X. Concluimos que el enfoque experimental descrito anteriormente se puede aplicar con éxito a la validación de objetivos putativos en diversas vías de regulación.