Name: Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprende técnicas de microinyección embrionaria para CRISPR/Cas9 en Culex quinquefasciatus. Este protocolo optimizado genera mutaciones heredables con tasas de supervivencia del 64-82% y mutagénesis germinal superior al 61%.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de inicio de UCSD dirigidos a O.S.A.

1. Cría de colonias de C. quinquefasciatus
<ol><li>Establezca múltiples colonias de adultos de C. quinquefasciatus en jaulas de dormitorios de insectos. NOTA: Las colonias fueron proporcionadas por la Dra. Laura Harrington en la Universidad de Cornell20. Los protocolos detallados para la cría de mosquitos Culex se pueden encontrar en otra literatura21.<ol>
<li>Mantenga los mosquitos a 25 ± 1 °C al 30% de humedad con un ciclo día:noche de 12:12 h.</li>
		<li>Proporcione una solución de azúcar al 20% ad libitum introduciendo un recipiente de solución de azúcar con una mecha en la jaula o saturando bolas de algodón con la solución de azúcar y colocándola dentro de la jaula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permita que los mosquitos se apareen durante al menos 3 días antes de la alimentación con sangre(Figura 2A).</li>
</ol>2. Colección de embriones en estadio pre-blastodermo de C. quinquefasciatus
<ol><li>Después de 3-6 días después de la eclosión, proporcione a las hembras 1-2 ml de harina de sangre bovina citrada a través de una membrana sintética y calentada a aproximadamente 40 ° C en un sistema de alimentación sanguínea(Figura 2B). También existen protocolos alternativos de alimentación sanguínea que se pueden utilizar para los mosquitos Culex (por ejemplo, ver ref21). NOTA: C. quinquefasciatus es conocido por su preferencia por la sangre aviar. Algunos laboratorios utilizan aves vivas anestesiadas o sangre aviar para su fuente de harina de sangre21,22,23. Sin embargo, las colonias pueden ser entrenadas / seleccionadas para alimentarse de sangre bovina o pequeños roedores si esta característica se selecciona para más de varias generaciones.<ol>
<li>Permita que las hembras descansen durante un mínimo de 3 días después de la alimentación sanguínea para someterse a oogénesis y maduración de los huevos antes de inducir la oviposición para experimentos de microinyección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día de las microinyecciones embrionarias, cree una taza de oviposición con agua de oviposición infundida orgánicamente. El agua de oviposición debe hacerse fermentando heces de conejo (50 g / L), pasto en descomposición (4.5 g / L) o alimentos para peces (25 g / L) en agua en el transcurso de 5 o más días24,25.</li>
	<li>Coloque la copa de oviposición en la jaula y coloque toda la jaula en un lugar oscuro (Figura 2C).</li>
	<li>Después de cada 30 minutos, revise la taza en busca de balsas de huevos.<ol>
<li>Si hay balsas de huevos presentes, recoja las balsas recogiéndolas con un pincel y colóquelas en un papel de filtro húmedo(Figura 2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alineación de embriones en estadio pre-blastodermo de C. quinquefasciatus
<ol><li>Separe los huevos de las balsas presionando hacia abajo en la balsa y separando los huevos individualmente usando un pincel de punta fina y fórceps(Figura 2E).</li>
	<li>Alinee los huevos individuales en una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara colocada en la parte superior de un portaobjetos de vidrio(Figura 2F).</li>
	<li>Mientras se alinea, trate de apuntar el lado anterior de cada huevo en la misma dirección para facilitar la accesibilidad. NOTA: Un método alternativo de alineación de óvulos sin cinta adhesiva de doble cara se puede encontrar en un protocolo de microinyección de embriones nasonia vitripennis publicado anteriormente26.</li>
	<li>Cubra los huevos con la mezcla de aceite de halocarbono. NOTA: La mezcla de halocarbono se puede preparar con anticipación mezclando suavemente dos reactivos de halocarbono y agua (9: 1: 20, halocarbono 700: halocarbono 27: agua ultrapura) y luego incubando la mezcla durante la noche a 25οC para facilitar la saturación de agua del aceite de halocarbono.</li>
</ol>4. Preparación de la aguja para microinyecciones
<ol><li>Genere las agujas de vidrio capilar de aluminosilicato utilizando un arrancador de micropipetas de vidrio.<ol>
<li>Coloque un vidrio capilar de aluminosilicato en un extracdor de agujas, según las instrucciones del manual del usuario del expilador de agujas. NOTA: También se pueden usar agujas capilares de cuarzo y borosilicato, pero para este experimento, se prefiere el aluminosilicato debido a su relativa asequibilidad y durabilidad.</li>
		<li>Ajuste el calor a 516, la velocidad a 100, el retardo a 70, el tirón a 97 y la presión a 500 en el arrancador de la aguja.</li>
		<li>Active el arrancador de agujas, según las instrucciones del jalador y repita según sea necesario para obtener agujas adicionales. NOTA: Durante el proceso de inyección, las agujas a menudo se obstruyen o se rompen accidentalmente, por lo tanto, se recomienda encarecidamente tirar de agujas adicionales para un solo experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bisela la punta de la aguja tocando suavemente la punta de la aguja tirada en la placa abrasiva de diamante giratoria durante unos 10 s en un ángulo de 50 °. NOTA: Biselar la aguja la abre para permitir que el líquido fluya a través de ella al tiempo que crea una punta más afilada para facilitar la penetración en el embrión. Un ejemplo de una aguja adecuada se puede ver en un artículo anterior26.</li>
	<li>Almacene las agujas tiradas y biseladas incrustándolas en líneas de arcilla del modelador en una placa de Petri. NOTA: Para garantizar la mejor calidad para las puntas de las agujas, las agujas deben ser recién tiradas y biseladas lo más cerca posible del momento de la inyección.</li>
</ol>5. Carga de la mezcla de inyección
<ol><li>Prepare la mezcla de inyección que consiste en reactivos de modificación del genoma (por ejemplo, 200 ng / μL sgRNA y 200 ng / μL cas9 mezcla), o soluciones de inyección preferidas y manténgala en hielo. NOTA: Esta mezcla se puede preparar mientras se espera que se ponen los huevos. Se pueden encontrar más detalles sobre la producción y preparación de Cas9 y sgRNA para la microinyección en publicaciones anteriores27,28,29,30.</li>
	<li>Cargue 2 μL de mezcla de inyección en la aguja de inyección con una punta de microcargador.</li>
</ol>6. Configuración de microinyección
<ol><li>Coloque la aguja de inyección llena en un micromanipulador conectado a un microinyector electrónico.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de vidrio que contiene los huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto.</li>
	<li>Usando el micromanipulador y el microscopio compuesto, alinee la aguja para apuntar al extremo posterior del embrión en un ángulo de 25-35 °.</li>
</ol>7. Microinyección embrionaria (Figura 2G)
<ol><li>Inserte cuidadosamente la aguja en el embrión e inyecte la mezcla en una cantidad de aproximadamente el 10% del volumen del embrión (700-800 pL dependiendo del tamaño de los óvulos). NOTA: Al inyectar, el óvulo debe hincharse ligeramente, sin embargo, si se inyecta demasiado líquido, los huevos pueden estallar o el líquido citoplasmático puede filtrarse.</li>
	<li>Inyecte alrededor de 20 óvulos a la vez, luego deténgase y realice procedimientos de recuperación embrionaria. NOTA: Durante la inyección, hay una alta probabilidad de que las agujas se obstruyan o se rompan. Si se produce una obstrucción, que puede determinarse por la falta de líquido de inyección que fluye a través de la aguja, intente limpiar la aguja con la función de limpieza en el microinyector electrónico o intente volver a bisecer la aguja. Si ninguno de los pasos funciona, cambie rápidamente a una nueva aguja mientras se asegura de que los huevos preparados permanezcan humedecidos.</li>
</ol>8. Recuperación y eclosión de embriones
<ol><li>Deje los huevos sin perturbar durante al menos 5 minutos. Dentro de los 20 minutos posteriores a la inyección, retire cuidadosamente el aceite de halocarbono cepillando ligeramente con un pincel limpio(Figura 2H).</li>
	<li>Levante los huevos suavemente con un pincel y colóquelos en una taza de agua de doble destilación(Figura 2I). Tenga cuidado de mantener los huevos en la superficie del agua.</li>
	<li>Revise los huevos diariamente durante 7 días para la eclosión(Figura 2J).</li>
	<li>Seguir los procedimientos normales de cría de larvas21.</li>
</ol>9. Detección de la modificación del genoma
<ol><li>Examinar los mosquitos inyectados para detectar los fenotipos mutantes utilizando un estereoscopio (Figura 2K).<ol>
<li>Verificar mutaciones que no tengan un fenotipo fácilmente reconocible, mediante amplificación por PCR, ensayo T7 Endonucleasa I, y secuenciación por subcloning de la región diana31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establezca cruces adicionales entre individuos inyectados para detectar mutaciones hereditarios dentro de la línea germinal.</li>
</ol>

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</ol>

Con los esfuerzos recientes para generar herramientas de ingeniería genética para el control de mosquitos vectores, existe la necesidad de desarrollar y optimizar los protocolos de microinyección embrionaria para los vectores comunes de enfermedades de mosquitos. Aunque se han desarrollado métodos para los mosquitos Aedes y Anopheles, se ha explorado mínimamente un protocolo diseñado específicamente para Culex. En general, los protocolos de inyección de embriones de mosquitos se pueden dividir en 3 pasos generales: 1) recolección y preparación de embriones, 2) inyección de embriones y 3) recuperación posterior a la inyección. Para generar mutantes con éxito, los tres pasos deben optimizarse para la especie objetivo. Este protocolo modificado para la microinyección embrionaria es específico para la ingeniería genómica exitosa de mosquitos Culex.
Maximizar la recolección de embriones es un cuello de botella común en los protocolos de microinyección embrionaria. Para aumentar el número de huevos recolectados en un corto período de tiempo, los mosquitos fueron restringidos de un sustrato de oviposición durante 2-3 días después de la comida de sangre. Es importante tener en cuenta que C. quinquefasciatus tiende a preferir las fuentes de sangre aviar en lugar de las fuentes de mamíferos o la alimentación por membrana con sangre de mamíferos. Sin embargo, muchos investigadores tienen dificultades para adquirir una fuente confiable de aves vivas o sangre aviar para la alimentación sanguínea, por lo que las existencias de laboratorio se pueden adaptar para alimentarse de fuentes de sangre más accesibles. También es crucial utilizar agua rica en nutrientes para el sustrato de oviposición, ya que proporciona señales de oviposición para C. quinquefasciatus y la mayoría de los otros vectores de Culex. Hay muchos métodos para generar agua rica en nutrientes, que puede necesitar ser optimizada entre laboratorios para garantizar que haya un número adecuado de óvulos disponibles para la microinyección. Por ejemplo, mientras que este método fue el más exitoso con heces de conejo fermentadas en agua desionizada durante 5 o más días, otros investigadores tienen más éxito con la hierba o los alimentos para peces como fuente de nutrientes y algunos incluso con agua destilada21.
Dado que los mosquitos Culex ponen grupos de huevos en balsas, recolectar huevos es bastante simple. Los huevos simplemente se pueden recolectar recogiendo toda la balsa con un pincel. La separación de óvulos es más complicada, pero esencial para una inyección exitosa. Los huevos se pueden separar cuidadosamente de la balsa aplicando una suave presión hacia abajo entre los huevos con pincel o pinzas. Con un poco de práctica, múltiples usuarios pudieron separar de manera confiable los huevos individuales de las balsas de huevos. Después de separar cada huevo, los huevos se alinean en la misma orientación en cinta adhesiva de doble cara, que estabiliza los huevos durante la microinyección. Los huevos se inyectan en el extremo posterior cónico y la adición de aceite de halocarbono mantiene los huevos húmedos durante la manipulación.
Para limitar el daño embrionario durante la microinyección, las agujas de inyección deben tener la fuerza adecuada y estar biseladas en un ángulo apropiado. Las agujas de aluminosilicato biseladas durante 10 segundos en un ángulo de 50 ° tuvieron los mejores resultados, pero las agujas de borosilicato y cuarzo también pueden funcionar, a pesar de que pueden ser menos duraderas y más costosas. Además, el biselado adecuado de la aguja facilita un mejor flujo de las mezclas Cas9 y sgRNA y crea un punto más afilado para facilitar la penetración en el embrión. En muchos casos, el biselado también es una forma eficiente de reparar rápidamente las agujas obstruidas en lugar de dedicar el tiempo y el esfuerzo para reemplazar las agujas obstruidas.
Después de la inyección, los huevos deben permanecer intactos durante al menos 5 minutos con el aceite de halocarbono que se elimina inmediatamente después cepillándolo suavemente con un pincel limpio. Después de la eliminación del aceite de halocarbono, los huevos inyectados se pueden colocar en agua para eclosionar, lo que generalmente ocurre dentro de los 3 días posteriores a la inyección. Con práctica y un número suficiente de huevos, este protocolo puede lograr mutaciones somáticas y germinales consistentes en C. quinquefasciatus y es lo suficientemente versátil como para ser fácilmente adaptable a otros mosquitos Culex.

C. quinquefasciatus,comúnmente conocido como el mosquito doméstico del sur, es un vector competente de numerosos patógenos, incluido el virus del Nilo Occidental (WNV), la encefalitis japonesa, la encefalitis de San Luis y la encefalitis equina oriental. En particular, desde que se detectó por primera vez en Nueva York en 1999, el VNO se ha convertido en una importante enfermedad transmitida por vectores en todo el territorio continental de los Estados Unidos (EE. UU.) con más de 50,000 casos humanos reportados que resultaron en alrededor de 2,300 muertes entre 1999 y 20181, así como más de 4,500 casos equinos reportados entre 2008-20192. Además, al menos 23 especies de aves encontradas en América del Norte se han visto afectadas por infecciones por WNV con al menos 12 especies clasificadas como irrecuperables como resultado de WNV3. El impacto del WNV en las poblaciones humanas, equinas y aviares se debe al comportamiento oportunista de alimentación de sus vectores. Por lo general, las aves son los principales huéspedes del VNO, y los humanos y los caballos son huéspedes incidentales o sin salida. Algunos patógenos vectorados por C. quinquefasciatus solo infectan a aves como el parásito de la malaria aviar, Plasmodium relictum. En Hawái, C. quinquefasciatus es un vector principal de la malaria aviar y ha causado la extinción de muchas especies de aves nativas4,5.
Para controlar las enfermedades transmitidas por C. quinquefasciatus,los investigadores y las agencias de control de vectores han utilizado herramientas de control de la población de mosquitos comúnmente establecidas, como la aplicaciónde insecticidas 6,sin embargo, estos métodos son costosos, no específicos de la especie, y tienen una efectividad limitada ya que la resistencia a los insecticidas es alta en muchas poblaciones de C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Otras técnicas de control, como las estrategias de control poblacional basadas en Wolbachiase han desarrollado en los últimos años10,11,pero los costos de aptitud asociados con la infección por Wolbachia limitan la viabilidad de este enfoque para este vector12. También hay métodos de control de base genética que se han desarrollado en otras especies de mosquitos como Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 y Anopheles stephensi16, incluido el desarrollo de mosquitos resistentes a patógenos17,18,19, que también podrían desarrollarse para C. quinquefasciatus si las herramientas de ingeniería del genoma requeridas son desarrollado para esta especie. Sin embargo, la biología de C. quinquefasciatus difiere mucho de otros mosquitos vectores de Aedes y Anopheles, lo que ha dificultado el desarrollo de tecnologías genéticas similares en este vector. Con el advenimiento de las tecnologías de ingeniería genómica basadas en CRISPR, la ingeniería genómica precisa se ha vuelto cada vez más trivial, asequible y adaptable y, en consecuencia, ha llevado al desarrollo de nuevas herramientas genéticas en una amplia variedad de especies.
Para generar mutaciones con tecnologías basadas en CRISPR, una mezcla de proteína Cas9 y ARN guía sintético (sgRNA), complementaria a los loci deseados, se microinyecta en embriones en etapa pre-blastodermo. Dado que las hembras de C. quinquefasciatus ponen sus huevos en grupos unidos en una estructura de balsa flotante(Figura 1),a diferencia de la oviposición de huevos individuales, un rasgo de los mosquitos Aedes y Anopheles, las microinyecciones embrionarias son cada vez más complicadas en esta especie. Las larvas de Culex también emergen del lado anterior de cada huevo, que está en contacto con la superficie del agua(Figura 1),por lo que la orientación del huevo después de la manipulación es importante en esta especie. Aquí describimos un protocolo detallado diseñado para la microinyección de la proteína Cas9 y sgRNA en embriones de C. quinquefasciatus. Este protocolo ha sido diseñado para acomodar rasgos exclusivos de la biología de Culex con el fin de mejorar la supervivencia embrionaria y las tasas de mutación del genoma a través de ciertos pasos que son clave para la recolección oportuna de óvulos y la supervivencia de los óvulos.

<table><tbody><tr><td>Vaso de plástico transparente para mascotas de 9 oz</td><td>Karat</td><td>C-KC9 Cría de</td><td>insectos y recolección de huevos</td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio de aluminosilicato 1 mm (diámetro exterior) X 0,58 mm (diámetro interior)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td> También <td>se podían usar agujas de microinyección, borosilicato y cuarzo, pero preferimos el aluminosilicato</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>La colonia tardó varias generaciones en adaptarse a esta fuente de sangre. Es probable que otras fuentes de sangre sean igual de apropiadas. Consulte las notas de protocolo sobre la selección de la fuente de sangre.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Jaula de cría de insectos</td></tr><tr><td>Cas9 Protein con NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio compuesto</td> de microinyección <td>Olympus BX41</td><td></td><td>Microinjection, para inyección de embriones</td></tr><tr><td>Placa abrasiva de diamante (tamaños de punta de 0,7u a 2,0u)</td>Microinyección <td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>, para usar con biselado</td></tr><tr><td>Destilado de DNasa/Libre de RNasa Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Cinta de doble cara</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinyección, alineación de embriones</td></tr><tr><td>Microinyector programable Femtojet 4x o 4i</td><td>Microinyección Eppendorf</td><td></td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Femtotips Puntas de microcargador</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Microinyección Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Microinyección, recogida de embriones</td></tr><tr><td>Pincel de punta fina</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Microinyección, alineación de embriones Aceite</td></tr> de <tr><td>halocarbono 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Microinyección, alineación de embriones Aceite de</td></tr><tr><td>halocarbono 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Microinyección, alineación de embriones</td></tr><tr><td>Hemotek Hemotek</td><td></td><td>PS5</td><td>Mantenimiento de la línea</td></tr><tr><td>Biseladora de microelectrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinyección, biselado con aguja</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 o P-2000</td><td>Microinyección, extracción de aguja</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinyección, alineación de embriones</td></tr><tr><td>Arcilla de modelado que no se seca</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinyección, aguja almacenamiento</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Microinyección, para la alineación de embriones</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% solución de azúcar para adultos fuente de azúcar.</td></tr><tr><td>T7 Endonucleasa I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Preparación de materiales de microinyección</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Preparación de materiales de microinyección</td></tr><tr><td>Pinzas de punta ultrafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Microinyección, alineación de embriones</td></tr></tbody></table>

técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en culex quinquefasciatus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus es un vector de una amplia gama de enfermedades transmitidas por vectores como la malaria aviar, el virus del Nilo Occidental (WNV), la encefalitis japonesa, la encefalitis equina oriental, la filariasis linfática y la encefalitis de Saint Louis. En particular, la malaria aviar ha desempeñado un papel importante en la extinción de numerosas especies endémicas de aves insulares, mientras que el VNO se ha convertido en una importante enfermedad transmitida por vectores en los Estados Unidos. Para obtener más información sobre la biología de C. quinquefasciatus y ampliar su caja de herramientas de control genético, necesitamos desarrollar métodos más eficientes y asequibles para la ingeniería del genoma en esta especie. Sin embargo, algunos rasgos biológicos exclusivos de los mosquitos Culex, particularmente sus balsas de huevos, han dificultado la realización de procedimientos de microinyección necesarios para la ingeniería del genoma. Para abordar estos desafíos, hemos desarrollado un protocolo optimizado de microinyección embrionaria que se centra en mitigar los obstáculos técnicos asociados con las características únicas de los mosquitos Culex. Estos procedimientos demuestran métodos optimizados para la recolección de huevos, la separación de balsas de huevos y otros procedimientos de manejo esenciales para una microinyección exitosa en C. quinquefasciatus. Cuando se combinan con la tecnología de edición del genoma CRISPR / Cas9, estos procedimientos nos permiten lograr mutaciones de la línea germinal específicas del sitio, eficientes y heredables, que se requieren para realizar una ingeniería genómica avanzada y desarrollar tecnologías de control genético en este importante, pero actualmente poco estudiado, vector de la enfermedad.

En experimentos publicados anteriormente, este método se utilizó para generar con éxito mutaciones somáticas y de la línea germinal de un gen crítico para el desarrollo de la pigmentación del ojo oscuro, el blanco (CPIJ005542)30 (Tabla 1). Las mutaciones somáticas generadas por CRISPR/Cas9 se calificaron mediante el cribado de la pérdida de pigmentación en los ojos en etapa pupal de los individuos inyectados (G0). Las mutaciones somáticas generalmente estaban presentes como fenotipos en mosaico donde algunas pero no todas las células tienen el fenotipo mutante. Por ejemplo, las mutaciones somáticas del gen blanco dieron lugar a una mezcla de ommatidia con fenotipos que carecen de pigmentación y aquellos con un fenotipo pigmentado de tipo salvaje30. Sin embargo, cuando hubo una mutación de la línea germinal del gen blanco, la siguiente generación (G1)heredó el fenotipo completo de ojos blancos. Las tasas de mutación de la línea germinal se determinaron entrecruzando los individuos del mosaico G0 y puntuando para la descendencia de ojos completamente blancos (G1). Estos experimentos dieron como resultado una tasa de supervivencia embrionaria del 64% al 82%, así como una tasa de mutagénesis somática del 37% al 57% y una tasa de mutagénesis de la línea germinal del &gt;61%(Tabla 1). Al multiplexar los sgRNAs para apuntar a múltiples loci en el mismo gen, las tasas de mutagénesis somática y de la línea germinal aumentaron hasta un 86%(Tabla 1). Además, durante muchas generaciones, las existencias homocigotas viables de los mutantes blancos se han mantenido con éxito en el laboratorio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figura 1: Balsa de huevos de C. quinquefasciatus y morfología de huevo único. Vistas dorsales (A), laterales (B) y ventrales (C) de las balsas de huevos C quinquefasciatus. Las hembras de C. quinquefasciatus ponen sus huevos con el lado anterior más bulboso tocando la superficie del agua, mientras que el posterior más puntiagudo se aleja de la superficie del agua (D). A- anterior; P- posterior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figura 2: Cronología para la creación de mutantes de C. quinquefasciatus por microinyección. Cronología de la preparación de la colonia de C. quinquefasciatus y la recolección de embriones para microinyección(A-D). Los huevos recolectados se separan (E) alineados en la misma orientación y cubiertos con aceite de halocarbono (F). Los huevos se inyectan (G) y se deja reposar durante un mínimo de 5 minutos antes de retirar el aceite de halocarbono (H). Los huevos se transfieren a una fuente de agua limpia (I) para la eclosión (J) y se examinan para detectar fenotipos mutantes (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Supervivencia</td>
			<td colspan="3">Mosaicismo somático (G0)</td>
			<td>Mutagénesis de la línea germinal (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>G1 mutantes (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Tasas de supervivencia y mutación de embriones inyectados con ARNg únicos y multiplexados dirigidos a blancos. La tabla se reimprime con permiso de30

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Las técnicas de microinyección de embriones han allanado el camino para el desarrollo de numerosas herramientas de control de vectores basadas en la genética. Aunque numerosas especies de insectos tienen protocolos ya bien desarrollados, Culex quinquefasciatus sigue siendo relativamente poco estudiado. Este protocolo de microinyección ha sido diseñado específicamente para adaptarse a los rasgos biológicos únicos de Culex quinquefasciatus, incluida la recolección de huevos, la separación de la balsa de huevos y los procedimientos posteriores a la inyección.Es probable que este método se pueda adaptar a cualquier especie de Culex de interés, y se puede utilizar para estudiar la función de los genes o para generar tecnologías de control basadas en la genética para las especies de Culex. Comience separando los huevos de las balsas. Use pinzas o un pincel para presionar la balsa y separar los huevos individuales.Alinee los huevos en una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara colocada en la parte superior de un portaobjetos de vidrio, haciendo un esfuerzo por apuntar el lado anterior de cada huevo en la misma dirección. Prepare la mezcla de halocarbono mezclando suavemente los reactivos de halocarbono con agua e incubando la mezcla a 25 grados centígrados durante la noche. Cubra los huevos alineados con la mezcla de aceite de halocarbono.Para generar agujas para las microinyecciones, coloque un vidrio capilar de aluminosilicato en un extractor de agujas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste el calor a 560, la velocidad a 100, el retraso a 70, el tirón a 97 y la presión a 500. A continuación, active el extractor de agujas.Toque suavemente la punta de la aguja tirada en la placa abrasiva de diamante giratoria durante unos 10 segundos en un ángulo de 50 grados para biselar la punta de la aguja. Incrusta agujas tiradas y biseladas en líneas de arcilla de modelismo en una placa de Petri. Prepare la mezcla inyectable que consiste en reactivos de modificación del genoma y guárdela en hielo.Utilice una punta de microcargador para cargar dos microlitros de mezcla de inyección en la aguja de inyección. Coloque la aguja de inyección llena en un micromanipulador conectado a un microinyector electrónico y coloque el portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en la platina de un microscopio compuesto. Con el micromanipulador, alinee la aguja para apuntar al extremo posterior del embrión en un ángulo de 25 a 35 grados.Inserte con cuidado la aguja en el embrión e inyecte la mezcla en una cantidad de aproximadamente el 10% del volumen del embrión. Inyecte 20 óvulos a la vez, luego deténgase y realice los procedimientos de recuperación de embriones. Dentro de los 20 minutos posteriores a la inyección, retire con cuidado el aceite de halocarbono de los huevos cepillándolos ligeramente con un pincel limpio.Levanta los huevos con el pincel y colócalos en una taza de agua destilada doble, teniendo cuidado de mantener los huevos en la superficie. Durante los próximos siete días, revise los huevos diariamente para ver si eclosionan y siga los procedimientos normales de cría de larvas. Examinar los mosquitos inyectados para detectar los fenotipos mutantes con un estereoscopio.Este método se ha utilizado para generar con éxito mutaciones somáticas y de la línea germinal de un gen crítico para el desarrollo de la pigmentación de los ojos oscuros. Las mutaciones somáticas generadas por CRISPR-Cas9 se puntuaron mediante el cribado de la pérdida de pigmentación en los ojos de la etapa de pupila de los individuos inyectados. Las mutaciones somáticas generalmente estaban presentes como fenotipos de mosaico, donde algunas de las células, pero no todas, tenían el fenotipo mutante.Las tasas de mutación de la línea germinal se determinaron mediante el entrecruzamiento de individuos del mosaico G cero y la puntuación por descendencia de ojos completamente blancos. Estos experimentos dieron como resultado una tasa de supervivencia embrionaria del 64 al 82%, una tasa de mutagénesis somática del 37 al 57% y una tasa de mutagénesis germinal superior al 61%. Al multiplexar sgRNAs para dirigirse a múltiples loci en el mismo gen, las tasas de mutagénesis somática y germinal aumentaron hasta un 86%Además, durante muchas generaciones, las existencias homocigóticas viables de los mutantes blancos se han mantenido con éxito en el laboratorio.Para optimizar la supervivencia y las tasas de mutagénesis, todos los materiales, incluido el aceite de halocarbono, el líquido de inyección y las agujas, deben prepararse adecuadamente antes de intentar las microinyecciones. Esto permitirá un proceso de microinyección más ágil y centrado.

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