Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Las técnicas de microinyección de embriones han allanado el camino para el desarrollo de numerosas herramientas de control de vectores basadas en la genética. Aunque numerosas especies de insectos tienen protocolos ya bien desarrollados, Culex quinquefasciatus sigue siendo relativamente poco estudiado. Este protocolo de microinyección ha sido diseñado específicamente para adaptarse a los rasgos biológicos únicos de Culex quinquefasciatus, incluida la recolección de huevos, la separación de la balsa de huevos y los procedimientos posteriores a la inyección.

Es probable que este método se pueda adaptar a cualquier especie de Culex de interés, y se puede utilizar para estudiar la función de los genes o para generar tecnologías de control basadas en la genética para las especies de Culex. Comience separando los huevos de las balsas. Use pinzas o un pincel para presionar la balsa y separar los huevos individuales.

Alinee los huevos en una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara colocada en la parte superior de un portaobjetos de vidrio, haciendo un esfuerzo por apuntar el lado anterior de cada huevo en la misma dirección. Prepare la mezcla de halocarbono mezclando suavemente los reactivos de halocarbono con agua e incubando la mezcla a 25 grados centígrados durante la noche. Cubra los huevos alineados con la mezcla de aceite de halocarbono.

Para generar agujas para las microinyecciones, coloque un vidrio capilar de aluminosilicato en un extractor de agujas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste el calor a 560, la velocidad a 100, el retraso a 70, el tirón a 97 y la presión a 500. A continuación, active el extractor de agujas.

Toque suavemente la punta de la aguja tirada en la placa abrasiva de diamante giratoria durante unos 10 segundos en un ángulo de 50 grados para biselar la punta de la aguja. Incrusta agujas tiradas y biseladas en líneas de arcilla de modelismo en una placa de Petri. Prepare la mezcla inyectable que consiste en reactivos de modificación del genoma y guárdela en hielo.

Utilice una punta de microcargador para cargar dos microlitros de mezcla de inyección en la aguja de inyección. Coloque la aguja de inyección llena en un micromanipulador conectado a un microinyector electrónico y coloque el portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en la platina de un microscopio compuesto. Con el micromanipulador, alinee la aguja para apuntar al extremo posterior del embrión en un ángulo de 25 a 35 grados.

Inserte con cuidado la aguja en el embrión e inyecte la mezcla en una cantidad de aproximadamente el 10% del volumen del embrión. Inyecte 20 óvulos a la vez, luego deténgase y realice los procedimientos de recuperación de embriones. Dentro de los 20 minutos posteriores a la inyección, retire con cuidado el aceite de halocarbono de los huevos cepillándolos ligeramente con un pincel limpio.

Levanta los huevos con el pincel y colócalos en una taza de agua destilada doble, teniendo cuidado de mantener los huevos en la superficie. Durante los próximos siete días, revise los huevos diariamente para ver si eclosionan y siga los procedimientos normales de cría de larvas. Examinar los mosquitos inyectados para detectar los fenotipos mutantes con un estereoscopio.

Este método se ha utilizado para generar con éxito mutaciones somáticas y de la línea germinal de un gen crítico para el desarrollo de la pigmentación de los ojos oscuros. Las mutaciones somáticas generadas por CRISPR-Cas9 se puntuaron mediante el cribado de la pérdida de pigmentación en los ojos de la etapa de pupila de los individuos inyectados. Las mutaciones somáticas generalmente estaban presentes como fenotipos de mosaico, donde algunas de las células, pero no todas, tenían el fenotipo mutante.

Las tasas de mutación de la línea germinal se determinaron mediante el entrecruzamiento de individuos del mosaico G cero y la puntuación por descendencia de ojos completamente blancos. Estos experimentos dieron como resultado una tasa de supervivencia embrionaria del 64 al 82%, una tasa de mutagénesis somática del 37 al 57% y una tasa de mutagénesis germinal superior al 61%. Al multiplexar sgRNAs para dirigirse a múltiples loci en el mismo gen, las tasas de mutagénesis somática y germinal aumentaron hasta un 86%Además, durante muchas generaciones, las existencias homocigóticas viables de los mutantes blancos se han mantenido con éxito en el laboratorio.

Para optimizar la supervivencia y las tasas de mutagénesis, todos los materiales, incluido el aceite de halocarbono, el líquido de inyección y las agujas, deben prepararse adecuadamente antes de intentar las microinyecciones. Esto permitirá un proceso de microinyección más ágil y centrado.