phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

La integrasa phiC31 es una enzima recombinasa derivada de fagos que cataliza la recombinación específica del sitio de un transgén, un gen extraño, en un genoma huésped. Para la integración transgénica en un huésped de Anopheles, comience con un embrión de Anopheles en un tampón adecuado.

El genoma de Anopheles está prediseñado con un sitio de unión para la integración de genes y un marcador cian-fluorescente para la selección visual. A continuación, agregue un pequeño volumen de plásmido donante que lleve la carga transgénica deseada, un sitio de unión, un marcador fluorescente rojo y componentes de la columna vertebral del plásmido a un vial. Luego, agregue un volumen óptimo de un plásmido auxiliar que lleve una integrasa que codifica genes. Ahora, cargue la mezcla de plásmidos en una microjeringa.

Inyecte suavemente los plásmidos en el polo posterior del embrión, el sitio de origen de las células germinales, lo que resulta en un ligero movimiento del citoplasma. Una vez dentro del embrión, el plásmido auxiliar comienza a sintetizar enzimas integrasas.

La enzima integrasa media la recombinación específica del sitio entre el plásmido donante y el genoma del huésped. Por lo tanto, el transgén y el marcador rojo fluorescente del plásmido donante se integran dentro de los sitios de unión recombinantes en el genoma de Anopheles. A continuación, incubar el embrión inyectado en condiciones fisiológicas para la eclosión, con remolino intermitente.

En cuestión de días, el embrión se convierte en larva. Bajo un microscopio de fluorescencia, la larva de Anopheles con genes integrados con éxito expresa tanto la fluorescencia cian, marcando el genoma del huésped, como la fluorescencia roja, marcando el transgén del plásmido donante.

Purifique los plásmidos donantes y auxiliares con un kit de purificación sin endotoxinas. Combine el plásmido donante marcado attB que lleva el transgén de interés y el plásmido auxiliar que lleva la integrasa, para obtener una mezcla con una concentración final de 350 nanogramos por microlitro del plásmido donante y 150 nanogramos por microlitro del plásmido auxiliar.

Precipitar el ADN agregando 0,1 volumen de acetato de sodio 3 molares, en 2,5 volúmenes de etanol 100% helado. Luego, vórtice. Un precipitado blanco debe ser inmediatamente visible. Lave el gránulo y vuelva a suspenderlo en tampón de inyección, para alcanzar una concentración final total de 500 nanogramos por microlitro. Luego, prepare alícuotas de 10 a 15 microlitros cada una y guárdelas a menos 20 grados centígrados.

Alimente con sangre a los mosquitos de 4 a 7 días de edad de la línea de acoplamiento deseada, y a sus contrapartes de tipo salvaje, 72 horas antes de la microinyección. Realice microinyecciones de embriones de Anopheles gambiae, en cloruro de sodio de 25 milimolares, dirigiéndose al polo posterior del embrión en un ángulo de 45 grados.

Realice microinyecciones de embriones de Anopheles stephensi, en aceite de halocarbono, apuntando al polo posterior en un ángulo de 30 grados. Inmediatamente después de la inyección, transfiera los huevos a una placa de Petri llena de agua destilada estéril y devuélvalos a condiciones insectarias. Al eclosionar, transfiera las larvas G₀ a una bandeja con agua destilada con sal todos los días y críelas a pupas.