쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

이 투명화 기술의 전반적인 목표는 쥐의 뇌에 대한 조직 제거법을 확립하는 것입니다. 이 프로토콜은 HIV-1 형질전환 쥐에도 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쥐의 뇌 조직을 투명하게 하기 위해 그대로 둘 수 있으므로 전체 회로 수준 분석이 가능하다는 것입니다.

제 연구실의 박사 과정 학생인 크리스틴 키르치너(Kristin Kirchner)와 제 연구실의 연구원인 하이롱 리(Hailong Li)가 시연할 예정입니다. 생후 3주에서 6주 된 쥐에서 경심 관류를 수행한 후 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 그런 다음 시상 위치에 놓고 면도날과 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 동일한 3mm 너비의 4 개로 자릅니다.

밀봉된 5ml 플라스틱 튜브에 4% PFA로 각 섹션을 고정하여 섭씨 4도의 셰이커에서 밤새 고정합니다. 다음 날에는 실온에서 1 시간 동안 고정을 계속하십시오. 각 섹션은 PBS로 세 번씩 세탁할 때마다 약 30분 동안 세탁합니다.

세척된 절편을 20, 40, 60, 80, 100% 메탄올 용액에서 각각 1시간 동안 연속적으로 배양합니다. 100% 메탄올로 탈수를 반복합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 100% 메탄올로 샘플을 10분 동안 냉각시킵니다.

66%DCM과 33%메탄올을 함유하는 용액을 준비하고 이 용액의 냉각된 부분을 실온에서 밤새 진탕하면서 배양합니다. 다음 날, 샘플을 메탄올로 30분 동안 두 번 세척하고 섭씨 4도의 100% 메탄올에서 10분 동안 냉각합니다. 표백을 위해 샘플을 메탄올에 5% 농도의 신선한 과산화수소에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

하룻밤 배양 후 실온에서 각각 1시간 동안 80, 60, 40 및 20% 메탄올 용액에서 샘플을 연속 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 샘플을 1시간 동안 배양하고 세척할 때마다 1시간씩 용액 1에서 두 번 세척합니다. 1ml 주사기에 2.5마이크로리터의 1% 비오틴-CTB를 채우고 20초에 걸쳐 측좌핵 부위에 천천히 주입합니다.

바늘 끝을 1분 동안 제자리에 두었다가 누출을 방지하기 위해 10초에 걸쳐 천천히 제거합니다. 용액 3에서 샘플을 배양한 다음 용액 4에서 각각 섭씨 37도의 수조에서 2일 동안 배양합니다. 그런 다음 1차 항체를 추가하고 7일 동안 배양을 계속합니다.

용액 2에서 세척당 1시간 동안 샘플을 5회 세척하고 용액 2에 넣어 실온에서 밤새 보관합니다. 2차 항체로 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 7일 동안 배양합니다. 마지막으로, 용액 2에 세척할 때마다 1시간 동안 5회 세척하고 용액 2에 넣어 실온에서 저조도에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

시료를 20, 40, 60, 80 및 100% 메탄올로 실온에서 각각 1시간 동안 연속으로 배양합니다. 그런 다음 신선한 100% 메탄올에서 밤새 배양합니다. 다음날, 33% 메탄올에 갓 준비된 66%DCM에 있는 검체를 진탕과 함께 실온에서 3시간 동안 배양합니다.

3시간 후, 투명해질 때까지 흔들지 않고 디벤질 에테르에 시료를 배양합니다. 그런 다음 이미징할 때까지 디벤질 에테르에 보관하십시오. 3D 프린터 챔버를 구하고 에폭시를 사용하여 현미경 슬라이드에 고정합니다.

챔버 중앙의 정사각형 공간에 샘플을 놓고 챔버를 디벤질 에테르로 완전히 채웁니다. 챔버 위에 0.17mm 두께의 커버 슬립을 놓고 챔버 벽과 완전히 접촉하도록 압력을 가합니다. 그런 다음 에폭시를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다.

충전 입구에서 기포가 빠져나갈 수 있도록 챔버를 회전해야 합니다. 챔버를 추가 디벤질 에테르로 채웁니다. 그런 다음 충전 주입구를 에폭시로 밀봉하고 경화시킵니다.

컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 표본을 관찰하여 4배 배율로 z 스캔을 수행합니다. 4배 배율에서 소수성으로 세척된 조직 샘플의 컨포칼 이미지는 흑질(substantia nigra) 영역에서 조밀한 TH 염색, 흑질(substantia nigra)에 인접한 희박한 TH 뉴런 및 TH 뉴런이 없는 조직의 짙은 검은색 영역을 보여줍니다. 20배 배율에서 TH 양성 뉴런의 일반적인 형태는 큰 소마와 여러 가지 분기 과정을 가지고 있습니다.

반면 IBA1 염색 미세아교세포는 세포체가 작고 확장 과정이 짧습니다. 이상적인 컨포칼 이미지는 적절한 형광 이득을 가진 흑질(substantia nigra) 영역에서 양성 및 조밀한 TH 염색을 보여줍니다. 불량한 컨포칼 이미지의 예로는 형광 이득이 너무 높아 초점이 맞지 않는 이미지, 나머지 조직과 초점이 맞지 않는 밝은 반점이 있는 위양성 염색, 2차 항체와 일치하지 않는 차단 혈청 사용으로 인한 높은 배경 염색

쥐의 뇌에서 CTB 염색이 양성인 것이 여기에 나와 있습니다. 길고 얇은 섬유는 도파민 경로를 따라 구심성 돌기입니다. TH와 CTB의 공동 국소화(Colocalization)는 조밀한 형광 녹색 원으로 나타나는 측좌핵 영역의 주입 부위를 시각화할 수 있습니다.

흑질(substantia nigra)에서 TH와 CTB의 공동 국소화(colocalization)가 여기에 나타나 있습니다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 사항은 샘플이 모든 항체 용액에서 배양할 수 있는 충분한 시간과 이미징 전에 완전히 제거될 수 있는 충분한 시간을 허용하는 것입니다. 샘플은 샘플이 손상될 수 있으므로 공기에 대한 노출을 제한해야 합니다.

이 기술은 매우 다재다능하며 뇌의 여러 영역에 걸쳐 관심 있는 다양한 단백질을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 현재의 기술은 신경과학자들이 전체 시스템으로서의 뇌 연구에 필수적인 회로 수준에서 쥐의 뇌를 조사할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 됩니다.