MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

Bienvenido al tutorial de CHI Lab sobre el método de la capa ultrafina, que es particularmente útil para la determinación precisa de la masa de las proteínas. Debido a la naturaleza sensible de la espectrometría de masas, solo utilizamos reactivos de grado HPLC, así como guantes de látex o nitrilo sin polvo para limpiar la placa. Enjuague alternativamente con agua con metanol y, finalmente, nuevamente con metanol.

Entre cada enjuague, limpie suavemente el exceso de solvente con un pañuelo para lentes. Puede repetir estos pasos de lavado tantas veces como sea necesario para producir una placa limpia. Y una vez limpia y seca, la placa debe usarse inmediatamente.

Aplique y extienda de 20 a 30 microlitros de solución de sustrato de capa delgada sobre la placa MALDI limpia. Aquí utilizamos una punta de pipeta P two 50 para distribuir uniformemente la solución evitando rayar la placa. A medida que la capa delgada se seca, elimine las gotas de agua restantes, si las hay, secándolas suavemente con una toallita kim.

A continuación, limpie suavemente la placa con un movimiento suave con una toallita Kim para formar correctamente la capa fina. Finalmente, limpie los bordes de la placa para evitar contaminar el espectrómetro de masas. Es crucial probar la capa delgada antes de aplicar su muestra.

Si el punto de prueba tarda demasiado en secarse donde los cristales no son homogéneos, el problema puede estar dentro de la capa delgada o en la solución de la matriz, limpie la placa, vuelva a aplicar la capa delgada y vuelva a probar. Al manchar la capa delgada, no querrás que tus manchas se evaporen hasta la sequedad. Más bien, una vez que la cristalización se haya ralentizado y detenido, elimine el exceso de solvente.

Al usar un aspirador de vacío, la presencia de contaminantes como sales y detergentes, así como una alta concentración de analito pueden interferir con la cristalización. Una mayor dilución de la muestra puede mejorar la cristalización: Detecte las hormigas muy cerca de la muestra. Esto permitirá una calibración pseudo interna en la que la placa se mueve del punto de muestra al punto de calibración.

Durante la adquisición de muestras, añadiendo unos pocos disparos láser del CAS al espectro, este enfoque garantiza una calibración de mayor precisión de masa que la calibración externa sola. Es muy importante lavar cualquier contaminante, como sal o detergente, que pueda interferir con el analito. Ionización. Para ello, deje caer agua helada con ácido acético trifluor al 0,1% en HPLC directamente sobre las manchas.

Retire la solución de lavado con un aspirador de vacío como se muestra aquí. Este método produce excelentes espectros tanto para las proteínas de membrana como para las solubles.