Name: Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a usar la herramienta E1A Minigene para evaluar cambios globales en el empalme de ARNm en células HEK 293. Este protocolo rápido y económico permite estudiar la regulación del empalme alternativo tras tratamientos quimioterapéuticos.

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Agradecemos a la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, a través de grant temático 2017/03489-1 a JK y beca a FLB 2018/05350-3) y al Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) por financiar esta investigación. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Adrian Krainer por proporcionar el plásmido pMTE1A y a Zerler y sus colegas por su trabajo en la clonación E1A. También agradecemos a la Prof. Dra. Patrícia Moriel, a la Prof. Dra. Wanda Pereira Almeida, al Prof. Dr. Marcelo Lancellotti y a la Prof. Dra. Karina Kogo Cogo Müller por permitirnos utilizar su espacio y equipo de laboratorio.

1. Células de chapado
NOTA: En este protocolo descrito, hek293 líneas celulares estables, previamente generado para la expresión inducible estable de Nek4 se utilizaron21,sin embargo, el mismo protocolo es adecuado para muchas otras líneas celulares, tales como HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. El patrón de expresión de las isoformas del minigén E1A en condiciones basales varía entre estas células y debe caracterizarse para cada condición. Este protocolo no se limita a líneas celulares estables. El enfoque más común en la evaluación de la proteína candidata es por co-transfección transitoria de aumentar su cantidad con la cantidad fija del minigén. El mismo protocolo es adecuado para las células knockout.
<ol><li>Celdas de placa considerando controles de vehículos, no transfectados y GFP.</li>
	<li>Cultivo de células HEK293 con expresión estable del gen de interés en el Medio Águila Modificada de Dulbecco (DMEM) suplementadas con un 10% de Suero Fetal Bovino (FBS), 4,5 g/L de Glucosa, 4 mM de L-Glutamina y se mantienen con 100 μg/mL de higromicina B, sobre placas tratadas con cultivo de tejidos a 37 °C enCO2 al 5% y una atmósfera humidificada.</li>
	<li>Dividir las células usando 0,25% tripsina-EDTA. Placa 3 x 105 células en placas de 6 pozos e incubarlas durante 24 h a 37 °C en 5% deCO2. NOTA: Para la transfección, las células deben ser 70-80% confluentes para disminuir la muerte celular después de la transfección.</li>
</ol>2. Transfección celular
NOTA: Aquí se utilizaron 1-2 μg de plásmido del minigén pMTE1A, sin embargo, la cantidad de ADN, así como el tiempo de expresión, deben mantenerse al mínimo para evitar toxicidad. Por ejemplo, se observó alta toxicidad en células HeLa después de 30 h de transfección con 1 μg de ADN pMTE1A. Para la transfección aquí descrita, se utilizó un reactivo de transfección a base de lípidos
<ol><li>Compruebe la confluencia celular 24 h después de chapado y transfectar hek293 células estables sólo cuando 70-80% confluyen.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular cuidadosamente con una pipeta, en lugar de usar un sistema de bomba de vacío. Luego agregue cuidadosamente 2 mL de medio DMEM completo sin antibióticos y vuelva a colocar la placa en la incubadora.</li>
	<li>Prepare un tubo con el tampón de transfección (200 μL/pozo), agregue 2 μg de ADN pMTE1A, vórtice y luego agregue 2 μL de reactivo de transfección. Vórtice de nuevo e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire las placas de la incubadora y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección gota a gota.</li>
	<li>A las células estables HEK293, añadir tetraciclina (0,5 μg/mL) para la inducción de la expresión de Nek4 6 h después de la transfección. El cambio de medio no es necesario. NOTA: Los volúmenes/cantidades descritos en esta sección son para un pozo. Prepare la mezcla para todos los pozos utilizados en el experimento en el mismo tubo.</li>
	<li>Prepare un pozo para transfectar con EGFP, u otro fluoróforo que exprese el plásmido para estimar la eficiencia de la transfección. Se pueden observar mejores resultados con una eficiencia de transfección de al menos el 40%, pero previamente se observaron buenos rendimientos con menor eficiencia de transfección.</li>
	<li>Cuando se utiliza la co-transfección (proteína de interés y minigene) mantener un pozo con células no transfectadas para evitar la obtención de resultados de ARNm endógeno. En el caso de E1A, las células HEK293 ya expresan el gen E1A30.</li>
</ol>3. Preparación de los medicamentos
NOTA: El tiempo y la concentración del tratamiento se eligieron en función de los resultados de la literatura, que señalan cambios en el empalme alternativo para algunos genes.
<ol><li>Realizar una curva dosis-respuesta antes de iniciar el ensayo para determinar la concentración mínima a la inducción de empalme alternativo sin ningún efecto en la viabilidad celular.</li>
	<li>Prepare una solución común de Paclitaxel a una concentración de 5 mM en etanol. La concentración final es de 1 μM. Mantener a -20 °C. Utilice etanol al 0,02% como control del vehículo.</li>
	<li>Preparar una solución de cisplatino diluyendo en NaCl al 0,9% a alrededor de 0,5 mg/mL (1,66 mM). Proteger de la luz, vórtice e incubar en un baño termal, 37 °C durante 30 min. La concentración final es de 30 μM. Preparar fresco o conservar a 2-10 °C hasta un mes. NOTA: Todos los medicamentos deben estar protegidos de la luz.</li>
</ol>4. Tratamiento y recolección celular
NOTA: Las células estables HEK293 se recogieron 48 h después de la transfección y para ello se trataron 24 h después de la transfección porque el nivel de expresión más alto de Nek4 se alcanza dentro de las 48 h. Sin embargo, los niveles de la expresión de la isoforma 13S (hasta el 90%) fueron observados en este tiempo. Para disminuir la proporción de isoforma 13S, trate de tratar y recoger las células 30 h después de la transfección máxima.
<ol><li>Use puntas y tubos libres de ARN/DNasa. Realice la extracción total del ARN con el reactivo del fenol-cloroformo siguiendo la recomendación del fabricante.</li>
	<li>24 h después de la transfección, verificar la morfología celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular, preferentemente utilizando una pipeta en lugar de un sistema de bomba de vacío. A continuación, añadir el medio de cultivo celular con los quimioterapéuticos en la concentración final previamente descrita.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% co2 durante 18 - 24 h.</li>
	<li>Recoja el ARN desechando el medio de cultivo celular en un recipiente y agregando 0.5 - 1 mL de reactivo de extracción de ARN directamente al pozo. Si los pozos son muy confluentes, utilice 1 mL de reactivo de extracción de ARN para mejorar la calidad del ARN.</li>
	<li>Homogeneizar con la pipeta y transferir a un tubo centrífuga de 1,5 mL. En este punto, el protocolo se puede pausar almacenando muestras a -80 °C o proceder inmediatamente a la extracción de ARN. ADVERTENCIA: El reactivo de extracción de ARN a base de fenol es tóxico y todos los procedimientos deben realizarse en una campana química de humos y los residuos deben eliminarse correctamente.</li>
</ol>5. Extracción de ARN y síntesis de ADNc
<ol><li>En una campana extractora descongelar las muestras e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 0,1 -0,2 mL de cloroformo y agitar vigorosamente.</li>
	<li>Incubar durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g y 4 °C.</li>
	<li>Recoja la fase acuosa superior y transfiera a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL. Recoger alrededor del 60% del volumen total; sin embargo, no recoja el ADN ni la fase orgánica (inferior).</li>
	<li>Añadir 0,25 - 0,5 mL de isopropanol y agitar por inversión 4 veces. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min, a 4 °C y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Lave el pellet de ARN dos veces con etanol (75% en agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC)). Centrífuga a 7.500 x g durante 5 min y deseche el etanol.</li>
	<li>Retire el exceso de etanol invirtiendo el tubo en un papel toalla y luego deje el tubo abierto dentro de una campana extractora de humos para secar parcialmente el pellet durante 5 - 10 min.</li>
	<li>Resuspend el pellet de ARN en 15 μL de agua tratada con DEPC.</li>
	<li>Cuantifique el ARN total usando la absorbancia en 230 nanómetro, 260 nanómetro, y 280 nanómetro para verificar calidad del ARN.</li>
	<li>Para verificar la calidad total del ARN, ejecute un gel de agarosa al 1% pre-tratado con 1,2% (v/v) de una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% durante 30 min31.</li>
	<li>Realizar la síntesis de ADNc utilizando 1-2 μg de ARN total.<ol>
<li>Pipetear ARN, 1 μL de oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) y componer el volumen a 12 μL con agua libre de nucleasa. Incubar en el termociclador durante 5 min a 65 °C.</li>
		<li>Retire las muestras del termociclador para enfriar y preparar la mezcla de reacción: 4 μL de tampón de la transcriptasa inversa, 2 μL de ditiothreitol (TDT) y 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa. Incubar a 37 °C durante 2 min.</li>
		<li>Añadir 1 μL de transcriptasa inversa termoestable. Incubar a 37 °C durante 50 min e inactivar la enzima a 70 °C durante 15 min. NOTA: El ADNc se puede almacenar a -20 °C durante varias semanas. Realizar un control de la transcriptasa no inversa (TRN) para la contaminación genómica de la discriminación putativa de eventos de retención de intrones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PCR mínima del mínimo pMTE1A
<ol><li>Realizar PCR con la composición de la reacción (1,5 mM de MgCl2,0,3 mM de mezcla dNTP, 0,5 μM de cada cebador, 2,5 U de una Taq Polimerasa de arranque en caliente y 150 ng de ADNc) con las siguientes condiciones: 94 °C durante 2 min, 29 ciclos de: 94 °C durante 1 min, 50 °C durante 2 min, 72 °C durante 2 min, 72 °C durante 10 min.</li>
	<li>Cargue 20-25 μL del producto de PCR en un gel de agarosa al 3% que contenga manchas de ácido nucleico y funcione a 100 V durante aproximadamente 1 h.</li>
</ol>7. Análisis del gel utilizando un software de procesamiento y análisis de imágenes32
<ol><li>Después de la ejecución, fotografíe el gel (utilizando un sistema de adquisición de imágenes de gel) evitando cualquier saturación de banda y cuantifique las bandas utilizando un software de procesamiento de imágenes.</li>
	<li>Para la cuantificación considere las bandas a ~631 pb, ~493 pb y ~156 pb para corresponder a las isoformas 13S, 12S y 9S, respectivamente.</li>
	<li>En el menú Archivo del software, abra el archivo de imagen obtenido del sistema de adquisición de imágenes. Convierta a escala de grises, ajuste el brillo y el contraste y elimine el ruido de valores atípicos si es necesario.</li>
	<li>Dibuje un rectángulo alrededor del primer carril con la herramienta Selección de rectángulo y selecciónelo a través de la | Analizar Geles | Seleccione el comando Primer carril o pulse el método abreviado de teclado para él.</li>
	<li>Utilice el ratón para hacer clic y mantener en el centro del rectángulo en el primer carril y arrástrelo hacia el siguiente carril. Ir a Analizar | Geles | Seleccione Carril siguienteo pulse el acceso directo disponible. Repita este paso en todos los carriles restantes.</li>
	<li>Después de que todos los carriles estén resaltados y numerados, vaya a Analizar | Geles | Trazar carriles para dibujar una gráfica de perfil de cada carril.</li>
	<li>Con la herramienta Selección en línea recta, dibuje una línea a través de la base de cada pico correspondiente a cada banda, dejando fuera el ruido de fondo. Después de que todos los picos, de cada carril, se ha cerrado, seleccione la herramienta Varita y haga clic dentro de cada pico. Para cada pico resaltado, las mediciones deben aparecer en la ventana Resultados que aparece.</li>
	<li>Sume la intensidad de las 3 bandas para cada muestra y calcule el porcentaje para cada isoforma en relación con el total.</li>
	<li>Trace los porcentajes de cada isoforma o las diferencias en el porcentaje en relación con las muestras no tratadas. NOTA: Asegúrese de que la suma de tres variantes E1A debe ser igual al 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+Regulatory+Networks%3A+Functions%2C+Mechanisms%2C+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing%3A+a+new+dimension+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li>
<li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li>
<li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).</li>
<li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li>
<li>Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li>
<li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li>
<li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts%3A+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3%27+splice+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li>
<li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li>
<li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li>
<li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li>
<li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li>
<li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li>
<li>Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).</li>
<li>Jarnæss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+Factor+Arginine%2FSerine-rich+17A+%28SFRS17A%29+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li>
<li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+of+human+Ki-1%2F57+with+pre-mRNA+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li>
<li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).</li>
<li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3%27+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF%2FSF2+and+hnRNP+A1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li>
<li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT%2FCGRP+precursor+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los minigenes son herramientas importantes para determinar los efectos en el empalme alternativo global in vivo. El minigén adenoviral E1A se ha utilizado con éxito durante décadas para evaluar el papel de las proteínas aumentando la cantidad de estas en la célula13,14. Aquí, proponemos el uso del minigén E1A para evaluar el empalme alternativo después de la exposición quimioterapéutica. Una línea celular estable que expresaba el isoform 1 Nek4 fue utilizada, evi...

El empalme es uno de los pasos más importantes en el proceso eucariota del mRNA que ocurre simultáneamente al 5' mRNA que tapa y al 3' poliadenylation del mRNA, comprendiendo del retiro del intrón seguido por la ensambladura del exón. El reconocimiento de los sitios que empalaban (SS) por el spliceosome, un complejo del ribonucleoprotein que contiene las pequeñas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 y U6), los pequeños RNAs (snRNAs) y varias proteínas reguladoras1 es necesario para empalmar.
Además de la extirpación de intrones (empalme constitutivo), en los eucariotas se pueden retener los intrones y se pueden excluir los exones, configurando el proceso llamado empalme alternativo de ARNm (EA). El empalme alternativo pre-ARNm amplía la capacidad de codificación de los genomas eucariotas permitiendo la producción de un número grande y diverso de proteínas a partir de un número relativamente pequeño de genes. Se estima que el 95-100% de los ARNm humanos que contienen más de un exón pueden someterse a empalme alternativo2,3. Esto es fundamental para procesos biológicos como el desarrollo neuronal, la activación de la apoptosis y la respuesta al estrés celular4,proporcionando al organismo alternativas para regular el funcionamiento celular utilizando el mismo repertorio de genes.
La maquinaria necesaria para el empalme alternativo es la misma utilizada para el empalme constitutivo y el uso de las SS es el principal determinante para la ocurrencia de empalme alternativo. El empalme constitutivo está relacionado con el uso de sitios de empalme fuerte, que suelen ser más similares a los motivos de consenso para el reconocimiento de spliceosomas5.
Los exones alternativos se reconocen típicamente menos eficientemente que los exones constitutivos una vez que sus elementos reguladores cis-,las secuencias en 5' SS y 3' SS flanqueando estos exones, demuestre una capacidad obligatoria inferior al emposoma. El ARNm también contiene regiones denominadas potenciadores o silenciadores ubicados en exones (potenciadores de empalme exónico (ESEs) y silenciadores de empalme exónicos (ESSs)) e intrones (potenciadores de empalme intrónico (ISEs) y silenciadores de empalme intrónico (ISSs)) que mejoran o reprimen el uso de exones, respectivamente5. Estas secuencias son reconocidas por elementos trans-reguladores, o factores de empalme (SF). Las SFs están representadas principalmente por dos familias de proteínas, los factores de empalme ricos en serina/arginina (SRSFs) que se unen a las EES y la familia de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) que se unen a las secuencias deLASE 5.
El empalme alternativo puede ser modulado por fosforilación/desfosforilación de factores trans que modifican las interacciones de los socios y localización celular de los factores de empalme6,7,8. La identificación de nuevos reguladores de los factores de empalme puede proporcionar nuevas herramientas para regular el empalme y, en consecuencia, algunos tratamientos contra el cáncer.
Anufrieva et al.9,en un perfil de expresión génica de microarrays de ARNm, observaron cambios consistentes en los niveles de componentes spliceosomales en 101 líneas celulares y después de diferentes condiciones de estrés (fármacos a base de platino, irradiación gamma, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la tirosina cinasa y taxanos). La relación entre el patrón de empalme y la eficacia de la quimioterapia ya se ha demostrado en células cancerosas de pulmón, que son resistentes a la quimioterapia, mostrando cambios en la tasa de variantes de la caspasa-910. Las células HEK293 tratadas con panel quimioterapéutico muestran cambios en el empalme con un aumento en las variantes pro-apoptóticas. Gabriel et al.11 observaron cambios en al menos 700 eventos de empalme después del tratamiento con cisplatino en diferentes líneas celulares, señalando que las vías de empalme están afectadas por el cisplatino. Los moduladores del empalme ya han demostrado actividad antitumoral, mostrando que el empalme es importante para el desarrollo tumoral y, principalmente, para la respuesta quimioterápica12. Por lo tanto, caracterizar nuevas proteínas que regulan el empalme después de agentes estresores celulares, como la quimioterapia, es muy importante para descubrir nuevas estrategias de tratamiento.
Las pistas de la regulación alternativa del empalme de estudios del interactome, particularmente importantes para caracterizar funciones de proteínas nuevas o no caracterizados, pueden exigir un acercamiento más general y simple para verificar el papel real de la proteína en COMO. Los minigenes son herramientas importantes para el análisis del papel general de una proteína que afecta a la regulación del empalme. Contienen segmentos de un gen de interés que contiene regiones genómicas alternativamente empalmadas y flanqueantes13. El uso de una herramienta minigénica permite el análisis del empalme in vivo con varias ventajas como la longitud del minigén que es menor y por lo tanto no es una limitación a la reacción de amplificación; el mismo minigén se puede evaluar en diferentes líneas celulares; todos los componentes celulares, principalmente su modificación postraduccional reguladora (fosforilación y cambios en los compartimentos celulares) están presentes y pueden ser abordados13,14. Por otra parte, se pueden observar cambios en el patrón de empalme alternativo después del estrés celular y, el uso de un sistema de minigenes, permiten identificar la vía modulada por diferentes estímulos.
Hay varios sistemas de minigenes ya descritos que son específicos para diferentes tipos de eventos de empalme13,14, sin embargo, como un ensayo preliminar, el minigén E1A15 es un sistema de reportero de empalme alternativo muy bien establecido para el estudio de la selección de 5 SS in vivo. A partir de un solo gen, E1A, cinco ARNm se producen por empalme alternativo basado en la selección de tres diferentes sitios de empalme de 5 ′ y de uno mayor o un menor 3 ′ sitio de empalme16,17,18. La expresión de las variantes de E1A cambia según el período de infección adenoviral19,20.
Hemos demostrado previamente que ambas isoformas Nek4 interactúan con factores de empalme como SRSF1 y hnRNPA1 y mientras que la isoforma 2 cambia el splicing alternativo del minigén E1A, la isoforma 1 no tiene ningún efecto en esa21. Porque el isoform 1 es el isoform más abundante y cambia resistencia de la quimioterapia y respuesta del daño de la DNA, evaluamos si podría cambiar el empalme alternativo del minigene E1A en una condición de la tensión.
El ensayo de minigene es un método sencillo, de bajo coste y rápido, ya que solo necesita extracción de ARN, síntesis de ADNc, amplificación y análisis de gel de agarosa, y puede ser una herramienta útil para evaluar desde un posible efecto sobre el empalme alternativo por una proteína de intereses hasta el efecto de diferentes tratamientos sobre el patrón de empalme alternativo celular.

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos placa</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC agua</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - FBS</td><td></td><td></td> Microscopio fluorescente ThermoFisher 12657029 <td></td>Sistema de</tr> adquisición de imágenes <tr><td></td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Gel - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células estables HEK293 - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Generado a partir de Flp-In&trade; T-REx&comercio; 293 - Invitrogen y descrito en la ref 21</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Utilizado para el mantenimiento de células Flp-In</td></tr><tr><td>Software de procesamiento y análisis de imágenes - FIJI software</td><td></td><td></td><td>ref. 32</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección a base de lípidos - jetOPTIMUS Reactivo Polyplus</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas/ Absorbancia UV</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek/ Take3</td></tr><tr><td>plásmido</td><td></td><td></td> pMTE1A <td>proporcionado por el Dr. Adrian Krainer</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa - Superíndice IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la ribunucleasa RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo a base de fenol-cloroformo para extracción de ARN - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Tinción de gel de ADN</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo 10966026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Se utiliza para Bandera vacía o Nek4- Inducción de expresión de bandera</td></tr><tr><td>Termociclador Bio-Rad Bio-Rad</td><td></td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de la herramienta e1a minigene para estudiar los cambios en el empalme de arnm

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

El procesamiento del ARNm implica múltiples pasos simultáneos para preparar el ARNm para la traducción, como el 5'capping, la adición de poli-A y el empalme. Además del empalme constitutivo, el empalme alternativo del ARNm permite la expresión de proteínas multifuncionales a partir de un gen. Como los estudios de interactomas son generalmente el primer análisis de proteínas nuevas o desconocidas, la asociación de la proteína de cebo con factores de empalme es una indicación de que puede participar en el proceso de empalme de ARNm, pero determinar en qué contexto o qué genes están regulados es un proceso empírico. Un buen punto de partida para evaluar esta función es el uso de la herramienta clásica de minigene. Aquí presentamos el uso del minigene adenoviral E1A para evaluar los cambios que empalme alternativos después de diversos estímulos celulares de la tensión. Se evaluó el empalme del minigén E1A en HEK293 establemente sobreexpresando la proteína Nek4 después de diferentes tratamientos de estrés. El protocolo incluye transfección de minigenes E1A, tratamiento celular, extracción de ARN y síntesis de ADNc, seguido de pcr y análisis de gel y cuantificación de las variantes empalmeadas E1A. El uso de este método simple y bien establecido combinado con tratamientos específicos es un punto de partida confiable para arrojar luz sobre los procesos celulares o qué genes pueden ser regulados por el empalme de ARNm.

Un 5' el análisis de los sitios del empalme usando el minigene de E1A fue realizado para evaluar cambios en perfil que empalmaba en células después de la exposición de la quimioterapia. Se evaluó el papel de Nek4-isoforma 1 en la regulación de AS en células estables HEK293 después del tratamiento con paclitaxel o cisplatino.
La región adenoviral de E1A es responsable de la producción de tres mRNAs principales a partir de un prec...

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía detallada para utilizar el minigén E1A2 para evaluar los cambios globales de empalme de ARNm. Esta es una herramienta rápida, económica y simple para evaluar la función de la proteína diana en la regulación alternativa del empalme sin la necesidad de regímenes especiales o condiciones de laboratorio. Comience por el cultivo de células HEK 293 con expresión estable del gen de interés.Divida las células usando EDTA de tripsina al 0,25%, luego platee 300, 000 células por pocillo en placas de seis pocillos e incube durante 24 horas a 37 grados Centígrados en dióxido de carbono al 5%. Después de 24 horas, compruebe la confluencia y transfecte las células estables HEK 293 solo cuando sea 70 a 80% confluyente. Retire cuidadosamente el medio de cultivo celular con una pipeta, luego agregue dos mililitros de medio DMEM completo sin antibióticos y vuelva a colocar la placa en la incubadora.Prepare un tubo con el tampón de transfección, luego agregue dos microgramos de ADN pMTE1A, vórtice y agregue dos microlitros de reactivo de transfección. Vórtice de nuevo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire las placas de la incubadora y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en cuanto a gotas.Seis horas después de la transfección, agregue tetraciclina a las células estables HEK 293 para la inducción de la expresión de Nek4. 24 horas después de la transfección, verifique la morfología celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio fluorescente. Use una pipeta para extraer el medio de cultivo celular y, a continuación, agregue el medio de cultivo celular con los quimioterapéuticos.Incubar las células durante otras 24 horas. Para recolectar ARN, deseche el medio de cultivo celular y agregue de 0.5 a 1 mililitro de reactivo de extracción de ARN directamente al pozo. Si los pozos son muy confluentes, utilice un mililitro de reactivo de extracción de ARN para mejorar la calidad del ARN.Homogeneizar las células con una pipeta y transferirlas a un tubo centrífuga de 1,5 mililitros. Proceda inmediatamente a la extracción del ARN, o almacene las muestras en menos 80 grados centígrados. Descongelar las muestras en una campana extractora de humos e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Añadir de 0,1 a 0,2 mililitros de cloroformo y agitar vigorosamente, luego incubar durante tres minutos a temperatura ambiente. Centrífuga durante 15 minutos a 12, 000 veces G y cuatro grados Celsius, luego recoja la fase acuosa superior y transfilíquela a un nuevo tubo centrífuga de 1.5 mililitros. Recoger alrededor del 60% del volumen total, pero no recoger el ADN o la fase orgánica.Añadir de 0,25 a 0,5 mililitros de isopropanol y agitar la muestra por inversión cuatro veces. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugar a 12,000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados y desechar el sobrenadante. Lave el pellet de ARN dos veces con etanol y centrífuga a 7, 500 veces G durante cinco minutos, luego deseche el etanol.Retire el exceso de etanol invirtiendo el tubo en una toalla de papel, luego deje el tubo abierto dentro de una campana extractora de humos para secar parcialmente el pellet durante cinco a 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet de ARN en 15 microlitros de agua tratada con DEPC. Cuantifique el ARN total y verifique la calidad del ARN midiendo la absorbancia a 230, 260 y 280 nanómetros.Para verificar la calidad total del ARN, ejecute un gel de agarosa al 1% pretratado con un 1,2% de una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% durante 30 minutos. Realice la síntesis del cDNA usando uno a dos microgramos de ARN total. Combine el ARN, un microlitro de oligo d-T, un microlitro de DNTP y agua libre de nucleasa a 12 microlitros.Incubar la reacción en el Thermo Cycler durante cinco minutos a 65 grados Centígrados. Retire las muestras del Thermo Cycler y agregue cuatro microlitros de tampón de la transcriptasa inversa, dos microlitros de TDT y un microlitro del inhibidor de la ribonucleasa. Incubar a 37 grados centígrados durante dos minutos.Agregue un microlitro de transcriptasa inversa termoestable e incube a 37 grados Centígrados durante 50 minutos. Inactivar la enzima a 70 grados Centígrados durante 15 minutos. Realice la POLIMERIZACIÓN EN CADENA como se describe en el manuscrito del texto, después cargue 20 a 25 microlitros del producto de la polimerización en cadena en un gel de la agarosa del 3% que contiene la mancha del ácido nucleico, y funcione en 100 voltios por aproximadamente una hora.Fotografíe el gel, evitando cualquier saturación de bandas, y cuantifique las bandas utilizando un software de procesamiento de imágenes. Las bandas en 631, 493, y 156 pares de bases corresponden a las isoformas 13S, 12S y 9S respectivamente. En el menú Archivo del software, abra el archivo de imagen y conviértalo en escala de grises.Ajuste brillo y contraste y, a continuación, elimine el ruido de valores atípicos si es necesario. Dibuje un rectángulo alrededor del primer carril con la herramienta de selección de rectángulo y selecciónelo a través del comando Analizar, Geles y Seleccionar primer carril, o mediante el método abreviado de teclado. Utilice el ratón para hacer clic y mantener en el centro del rectángulo en el primer carril, y arrástrelo al siguiente carril.Vaya a Analizar, Geles y Seleccionar el carril siguiente. Repita este paso para todos los carriles restantes. Después de que todos los carriles estén resaltados y numerados, vaya a Analizar, Geles y Trazar carriles para dibujar un diagrama de perfil de cada carril.Utilice la herramienta de selección de línea recta para dibujar una línea a través de la base de cada pico, correspondiente a cada banda, dejando fuera el ruido de fondo. Después de que todos los picos de cada carril se hayan cerrado, seleccione la herramienta varita y haga clic dentro de cada pico. Las mediciones deben aparecer en la ventana de resultados para cada pico resaltado.Considere solamente los picos 13S, 12S, y 9S correspondientes a las bandas de los pares de bases 631, 493, y 156. Copie los datos de intensidad de un editor de hojas de cálculo y sume la intensidad de las tres bandas para cada muestra y, a continuación, calcule el porcentaje de cada isoforma en relación con el total. Trazar los porcentajes de cada isoforma, o las diferencias en el porcentaje en relación con las muestras no tratadas.Un plásmido que contenía el minigene de E1A fue utilizado para observar el efecto sobre empalmar alternativo evaluando la proporción de mRNA de cada isoforma producida. La expresión básica de las variantes de las isoformas de E1A dependió de la línea celular y del tiempo de la expresión de E1A. La línea celular estable HEK 293, o el sitio que contenía la recombinasa HEK 293, mostró una expresión más alta de 13S en comparación con las células de HeLa, pero mostró niveles similares de isoformas 13S y 12S después de 48 horas de expresión de E1A.Las células expuestas al cisplatin mostraron un cambio en la selección que empalmaba de cinco primeros S-S que favorecía la expresión 12S. Este efecto se observó en HEK 293 expresando de forma estable el vector vacío flag, así como la isoforma uno de Nek4. Los cambios en el empalme alternativo después del tratamiento con paclitaxel fueron muy discretos, pero las direcciones de los cambios fueron opuestas en las células de expresión de Flag y Nek4.Al realizar este protocolo, es importante utilizar controles de transcriptasa no transfectados y no inversos para evitar la mala interpretación con la expresión endógena de E1A, principalmente cuando se usan células HEK 293. Tras la obtención de resultados positivos, se puede evaluar el empalme alternativo de genes específicos relacionados con la respuesta quimioterapéutica. Cuando se observa algún efecto, este protocolo simple puede dirigir estos estudios para vías más consistentes, donde la proteína desempeña un papel regulador del empalme alternativo en la respuesta a la quimioterapia, por ejemplo.

using-the-e1a-minigene-tool-to-study-mrna-splicing-changes

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Los eventos de empalme en tándem ocurren en sitios a menos de 12 nucleótidos de distancia. La cuantificación de las proporciones de dichas variantes de empalme es factible utilizando un enfoque de PCR cuantitativo absoluto. Este manuscrito describe cómo se pueden cuantificar las variantes de empalme del gen STAT3, en las que dos eventos de empalme dan lugar a la inclusión/exclusión de Serina-701 y a α/β C-terminal.

La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

Este artículo describe los procedimientos experimentales para (a) el agotamiento de U1 snRNP de extractos nucleares, con pérdida concomitante de la actividad de empalme; y (b) reconstitución de la actividad de empalme en el extracto agotado de U1 por partículas de galectina-3 - U1 snRNP unidas a perlas covalentemente acopladas con anticuerpos anti-galectina-3.

Complementación de la actividad de empalme por un complejo de galectina-3 - U1 snRNP en perlas

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.

Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

El ensayo ACT1-CUP1, un ensayo de crecimiento de cobre, proporciona una lectura rápida del empalme del ARN mensajero precursor (pre-ARNm) y el impacto que los factores de empalme mutante tienen en la función espliceosomal. Este estudio proporciona un protocolo y destaca la personalización posible para abordar la cuestión de empalme de interés.

Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.

Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

Aprende a usar la herramienta E1A Minigene para evaluar cambios globales en el empalme de ARNm en células HEK 293. Este protocolo rápido y económico permite estudiar la regulación del empalme alternativo tras tratamientos quimioterapéuticos.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

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