Name: Síntesis y caracterización de gotas de porfirina de cambio de fase multimodal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a sintetizar gotas de porfirina de cambio de fase multimodal mediante condensación de microburbujas sin presurización. Este protocolo permite caracterizar propiedades ópticas y acústicas para aplicaciones en neurociencia y ciencia de materiales.

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Los autores desean agradecer al Dr. Brandon Helfield por ayudar a construir el intercambiador de gas y al Dr. Miffy Hok Yan Cheng por las discusiones técnicas. Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiamiento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute y Princess Margaret Cancer Foundation.

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<li>Helfield, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+accumulation+of+submicron+phase-change+droplets+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891(2020).</li>
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<li>Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregate+enhanced+trimodal+porphyrin+shell+microbubbles+for+ultrasound%2C+photoacoustic%2C+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).</li>
<li>Dhaliwal, A., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+accessibility+of+EPR-insensitive+tumor+phenotypes+using+EPR-adaptive+strategies%3A+Designing+a+new+perspective+in+nanomedicine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery.</a> Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).</li>
<li>Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+size+distribution+measurements+of+Definity+and+manipulated+Definity+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).</li>
<li>Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold-dependent+nonlinear+scattering+from+porphyrin+nanobubbles+for+vascular+and+extravascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).</li>
<li>Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li>
<li>Overchuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtherapeutic+Photodynamic+Treatment+Facilitates+Tumor+Nanomedicine+Delivery+and+Overcomes+Desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia.</a> Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).</li>
<li>Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las imágenes de ultrasonido son una forma no invasiva y no ionizante de imágenes médicas que utiliza ondas acústicas. Mientras que los escáneres de ultrasonido son más portátiles y pueden proporcionar imágenes en tiempo real, las imágenes de ultrasonido pueden sufrir de bajo contraste, lo que dificulta que los ecografistas distingan de manera confiable características patológicas ecogénicas similares. Para contrarrestar esta limitación, se pueden inyectar microburbujas en el huésped para mejorar el contraste vascular. Las microburbujas son agentes de contraste llenos de gas del tamaño de micras que son altamente ecogénicos a las ondas acústicas y pueden proporcionar un contraste de recipiente mejorado1,2. Las carcasas y los núcleos de gas de las microburbujas se pueden adaptar para diferentes aplicaciones, como imágenes, trombólisis, permeabilización de la membrana celular o apertura vascular transitoria2.
Un inconveniente de las microburbujas es su corta circulación de vida media. Por ejemplo, las microesferas lipídicas de perflutrena clínicamente disponibles solo tienen una vida media de 1,3 minutos3. Para sesiones de imágenes largas, se necesitan múltiples inyecciones de microburbujas. Otro inconveniente de las microburbujas son sus grandes diámetros. Mientras que las microesferas lipídicas de perflutrena tienen alrededor de 1 a 3 μm de diámetro, lo suficientemente pequeñas como para circular en la vasculatura, son demasiado grandes para extravasar y acumularse pasivamente en tejidos de interés, como los tumores4. Una estrategia para superar estas limitaciones es condensar las microburbujas de núcleo de gas en gotas de núcleo líquido más pequeñas5,6. Si bien las gotas no son ecogénicas en su estado líquido, pueden vaporizarse en microburbujas al exponerse al ultrasonido con una presión negativa máxima suficientemente alta, recuperando su capacidad de proporcionar contraste. Esto permite que la gota aproveche la farmacocinética más favorable de un pequeño núcleo líquido, al tiempo que conserva la capacidad de proporcionar contraste cuando está insonado y sin cambiar la composición química4,7.
El decafluorobutano es un compuesto de perfluorocarbono ideal para el cambio de fase entre los estados gaseoso y líquido5,6,7. El decafluorobutano permite la condensación de microburbujas en gotas solo con reducción de temperatura, mientras que los perfluorocarbonos menos densos requieren presurización adicional5. Este método suave minimiza la destrucción de burbujas durante la condensación7,8,9. Como sus núcleos son líquidos, las gotas no son ecogénicas e invisibles para el ultrasonido. Sin embargo, con la aplicación de suficiente energía acústica o térmica, los núcleos líquidos pueden vaporizarse de nuevo en un estado gaseoso, generando microburbujas ecogénicas8. Esta vaporización permite controlar cuándo y dónde generar microburbujas.
Si bien las gotas son útiles para la acumulación pasiva, la vaporización in situ o la mejora de la permeabilidad celular4,las gotas (y sus fragmentos) no se pueden obtener imágenes ni cuantificar ex vivo. Por lo tanto, el agente de diagnóstico complementario cuantificable, como fluorescente4,10,11,partículas magnéticas12,agentes ópticamente absorbentes13,se utilizan como un análogo para medir la entrega de gotas a los tejidos de interés. Por ejemplo, Helfield et al. utilizaron una coinyección de nanoperlas fluorescentes para la cuantificación de imágenes histológicas de órganos de ratón ya que no se pudieron detectar gotas fluorescentemente4. La desventaja de los agentes de diagnóstico acompañantes es que el componente rastreable puede actuar independientemente de la gota dependiendo de su perfil farmacocinético individual.
Afortunadamente, la cáscara de microburbujas y gotas se puede personalizar. Por ejemplo, Huynh et al. demostraron agentes de contraste ecográfico con conchas de porfirina-lípido, creando microburbujas multimodales14. Las porfirinas son una clase de compuestos orgánicos con una estructura macrocítica aromática14,15. Son ópticamente absorbentes, fluorescentes y pueden quelatarse a una amplia variedad de metales para radioterapia, imágenes basadas en radionúclidos o cuantificación basada en metales traza14. Un ejemplo de porfirina es la pirofeofórbida (Pyro). Al conjugar Pyro sobre lípidos, la incorporación de pirolípidos en microburbujas o gotas permite que sean fotografiados y rastreados a través de múltiples modalidades: acústicamente, fluorescentemente y a través de absorbancia14. Este agente de contraste multimodal podría usarse para rastrear y cuantificar la acumulación. Esto podría eliminar la necesidad de agentes de diagnóstico complementarios, ya que el componente cuantificable ahora se conjuga en la carcasa, lo que permite una cuantificación de la entrega más precisa16.
Aquí, se describe un protocolo para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal. Como los agentes de contrastes de ultrasonido se pueden utilizar como una plataforma para la administración de fármacos a tejidos de interés, como los tumores2,4,extender su detectabilidad más allá del ultrasonido podría resultar útil para la cuantificación de la eficacia de la administración. El propósito de estas gotas es proporcionar agentes de contraste de ultrasonido rastreables capaces de acumulación pasiva in vivo,vaporización in situ y acústica, y con el potencial de cuantificar la biodisposición o acumulación de órganos ex vivo sin depender de sensores secundarios. Los métodos de caracterización también se describen para mostrar el potencial de las gotas de porfirina como sensores de biodisponsión. También se discuten los efectos de la carga de pirolipídicos en la cáscara (0% a 50% por proporción molar).

<table><tbody><tr><td>1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000] (sal de amonio)</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>880220</td><td>También conocido como "DSPE-PEG5K"</td></tr><tr><td>1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Ávidos polares</td><td>855775</td><td>También conocido como "DSPC"</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td> Cualquier <td>marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sellos de aluminio, Desprendible</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>Aluminio estándar, diámetro exterior de 13 mm</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>de baño Cualquier marca</td><td></td><td>Capaz de&nbsp; sonicar y calentar hasta 70 &ng; C,Viales</td></tr> <tr><td>con tapón de rosca Bio-Stor</td> National <td>Scientific</td><td>BS20NABP</td><td>plástico, 2 mL con faldón, con junta tórica</td></tr><tr><td>Viales de suero transparente de vidrio de borosilicato</td><td>VWR</td><td>16171-285</td><td>3 mL, 7 mm de diámetro de la boca interior, 13 mm de diámetro de la boca exterior</td></tr><tr><td>Vial de muestra de vidrio de borosilicato con tapón de rosca fenólico</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1,85 mL, estilo de forma corta, 12 mm de diámetro exterior, 35 mm de altura, tamaño</td></tr> <tr><td>de tapa de 8-425Vial de vidrio de borosilicato con tapa de rosca</td><td>Cualquier marca</td><td></td>, <td>los tamaños dependerán de los volúmenes deseados.</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter Diluyente Elctrolyte</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Compatible con Coulter Counter</td></tr><tr><td>Decafluorobutano (C4F10)</td><td>FluoroMed</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hielo seco (dióxido de carbono)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizador de partículas de dispersión dinámica de luz (DLS)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Capaz de control de temperatura</td></tr><tr><td>Engarzadora E-Z, Wheaton de 13 mm</td><td></td><td>W225302</td><td>Sellos de aluminio estándar de 13 mm</td></tr><tr><td>E-Z Decapper,</td><td>Wheaton</td><td>de</td> 13 mm W225352 <td>Sellos de aluminio estándar de 13 mm</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro fluorescente</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Capaz de 400 a 600 excitación y detección de emisiones de 300 a 800 nm, detector perpendicular a la fuente láser</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro fluorescente Cubeta compatible</td> Cualquier <td>marca</td><td></td><td>Puede contener al menos 2 mL, capaz de 300 a 800 nm, todos los cuatro lados son &nbsp; ventanas ópticas &nbsp;</td></tr><tr><td>Intercambiador</td><td>de gas de fabricación propia</td><td></td><td>Consulte la información complementaria - "Otros protocolos y datos" para obtener instrucciones de montaje.</td></tr><tr><td>Jeringas de vidrio</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>: Los tamaños dependerán de los volúmenes deseados</td></tr><tr><td>GLWR Custom Aperture Tube 10 mmm</td><td>Beckman Coulter</td><td>B42812</td><td>10 &micro; m apertura, compatible con Beckman Coulter MultiSizer 4e</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenedores de Styrofaom aislados con tapa</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapones de goma estilo liofilización</td><td>VWR</td><td>71000-060</td><td>7 mm de diámetro de boca interior, 13 mm de diámetro de boca exterior, 2 patas,</td></tr><tr><td>membrana de clorobutilo Bomba de vacío de diafragma</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16694-1-60-06</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas metálicas de</td> presión ajustable <td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz Transductor de ultrasonido de matriz lineal</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz, capaz de modo B e imágenes no lineales.</td></tr><tr><td>MultiSizer 4e</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Capaz de dimensionar desde 0.2 y micro; m a 6 y micro; m</td></tr><tr><td>Nalgene Unidades de filtro de vacío estériles de un solo uso</td> de flujo rápido Membrana de polietersulfona (PES) <td>Thermo Scientific</td><td>567-0010</td>, <td>0,1&mu; m tamaño de poro, volumen de 1000 mL. Como Isoton II no es estéril, puede usar unidades de filtro varias veces</td></tr><tr><td>Agujas,</td><td>BD</td> convencional <td>305176</td><td>calibre 20, 1.5 pulgadas de longitud</td></tr><tr><td>Gas nitrógeno Cualquier</td><td>marca</td><td></td><td>Asegúrese de que haya válvulas reguladoras y tubos para dirigir el flujo. La configuración dependerá de la marca y la fuente.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>llamada "película de cera" en el protocolo.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>1X, 7.4 Pipeta de pH</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Los tamaños dependerán de los volúmenes deseados</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Los tamaños dependerán de los volúmenes deseados</td></tr><tr><td>Jeringas de plástico</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>1 mL, 3 mL y 30 mL. Con conexiones Luer Lock</td></tr><tr><td>Filtro de membrana de polietersulfona (PES)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>0.2 y micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Propilenglicol</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirofeforbida conjugada 1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td>También conocido como "Pyro-SPC". Consulte "Información complementaria - Otros protocolos y datos" para obtener una síntesis.</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Cualquier marca</td><td></td> <td>(-20 a 100 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>También conocida como "2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol"</td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Tipo 1</td></tr><tr><td>Pureza Ultravioleta&ndash; Espectrofotómetro visible (UV-Vis)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Capaz de absorbancia de 300 a 800 nm, al menos 0,5 nm de resolución</td></tr><tr><td>Ultravioleta&ndash; Espectrofotómetro visible (UV-Vis) Cubeta compatible, 1 cm de longitud de paso</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Puede contener al menos 2 mL, capaz de 300 a 800 nm</td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de imágenes de ultrasonido Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>Sistema de imágenes de ultrasonido preclínico</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Bristol-Myers-Squibb</td><td></td><td>Llamado "agitador mecánico" en el protocolo. Agita durante 45 s.</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis y caracterización de gotas de porfirina de cambio de fase multimodal

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

Las gotas de cambio de fase son una clase de agentes de contraste de ultrasonido que pueden convertirse en microburbujas ecogénicas in situ con la aplicación de suficiente energía acústica. Las gotas son más pequeñas y más estables que sus contrapartes de microburbujas. Sin embargo, los agentes de contraste de ultrasonido tradicionales no son rastreables más allá de las mediciones de retroalimentación acústica, lo que dificulta la cuantificación de la biodis distribución o acumulación ex vivo del agente de contraste. Es posible que los investigadores tengan que confiar en partículas de diagnóstico acompañantes fluorescentes u ópticamente absorbentes para inferir la biodis distribución. El propósito de este protocolo es detallar los pasos para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal utilizando un método de condensación. Las porfirinas son moléculas fluorescentes con distintas bandas de absorbancia que pueden conjugarse en lípidos e incorporarse a gotas para extender la versatilidad de las gotas, lo que permite una biodisponsión más robusta al tiempo que conserva las propiedades acústicas. Se hicieron siete formulaciones con diferentes contenidos de lípidos de porfirina y lípidos base para investigar las distribuciones de tamaño de microburbujas y gotas. Las caracterizaciones adecuadas para las estructuras que contienen porfirina también se describen en el protocolo para demostrar su versatilidad analítica en solución. El tamaño mostró que los diámetros medio posteriores a la condensación fueron de 1,72 a 2,38 veces más pequeños que las poblaciones precursoras. La caracterización de la absorbancia mostró que los ensamblajes intactos tenían un pico de banda Q de 700 nm, mientras que las muestras interrumpidas tenían un pico de absorbancia a 671 nm. La caracterización de la fluorescencia mostró que los ensamblajes intactos de porfirina-lípido del 30% se apagaron fluorescentemente (>97%), con una recuperación de fluorescencia lograda tras la interrupción. La vaporización acústica mostró que las gotas de porfirina no eran ecogénicas a presiones más bajas y podían convertirse en microburbujas ecogénicas con suficientes presiones. Estas caracterizaciones muestran el potencial de las gotas de porfirina para eliminar la necesidad de absorbancia o estrategias de diagnóstico complementarias basadas en la fluorescencia para cuantificar la biodis distribución del agente de contraste de ultrasonido para la administración o aplicaciones terapéuticas in vivo o ex vivo.

Las muestras de microburbujas precondensadas y seleccionadas por tamaño(n = 3) y las muestras de gotas postcondensadas(n = 3) se dimensionaron en un contador de Coulter (CC) con una apertura de 10 μm. Una limitación de la apertura de 10 μm es que no puede medir partículas menores de 200 nm, lo que puede sesgar el tamaño medio y la concentración. La Figura 4 muestra los datos de tamaño para cada una de las formulaciones con contenido de pirolipídicos. La Tabla 1 muestra estadísticas basadas en los datos de tamaño. Utilizando una relación de diámetros medianos pre y postcondensados, los resultados mostraron que la formulación de pirolipídicos al 0% tuvo el menor cambio de diámetro medio con 1,72 ± 0,02. La formulación de pirolipídicos al 50% tuvo el mayor diámetro medio con 2,38 ± 0,08. La muestra de gotas de pirolipídicos al 1% tuvo la concentración más alta observada en (2.71 ± 0.13) × 1010 / ml, mientras que la muestra de gotas de pirolipídicas al 40% tuvo la concentración observada más baja en (7.36 ± 0.81) × 109 / ml. Los datos de dimensionamiento mostraron que la muestra de gotas de pirolipídicos al 10% tenía el dímetro de pico más pequeño a 261 ± 13 nm, mientras que la muestra de gotas de pirolipídicos al 50% tenía el más grande con 390 ± 55 nm. En general, a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración disminuía y el diámetro medio aumentaba. Como las muestras post-condensadas se basan en la muestra de microburbujeo precursora, la tendencia ocurrió para ambos tipos de agentes de contraste de ultrasonido. A medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, comenzó a formarse una subpoblación de microburbujas (con un tamaño máximo de aproximadamente 2000 μm). Este pico secundario no estuvo presente en la muestra de microburbujas pirolipídicas al 0% y fue más evidente en las poblaciones de pirolipídicos al 40% y 50%.
La Figura 5 muestra mediciones representativas de absorbancia de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30%. El pico de la muestra intacta en PBS fue de 700 nm, mientras que la muestra interrumpida en Tritón cambió el pico a 671 nm. Esto mostró que los ensamblajes intactos tienen diferentes propiedades ópticas en comparación con los componentes lipídicos individuales no ensamblados.
La Figura 6A muestra mediciones representativas de fluorescencia de la muestra de microburbuja precondensada, mientras que la Figura 6B muestra de gotas postcondensadas con 30% de pirolípidos. La muestra intacta en PBS tuvo un pico de fluorescencia a 704 nm, mientras que la forma interrumpida tuvo un pico a 674 nm. Restando el área interrumpida debajo de la curva con el área intacta debajo de la curva, y dividiendo la diferencia por el área interrumpida debajo de la curva se obtiene la eficiencia de enfriamiento, que resulta ser 98.61% y 98.07% para la muestra de microburbuja pirolipídica del 30% y la muestra de gotas, respectivamente.
Para demostrar que las gotas se convierten en microburbujas, se tomaron imágenes de gotas diluidas y se vaporizaron en un fantasma de flujo de 37 ° C con un sistema de ultrasonido. La Figura 7 muestra imágenes de ultrasonido representativas de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30% fotografiada a diferentes presiones. A bajas presiones(Figura 7A),había muy poca señal, solo señal de fondo de burbujas de aire pegadas de la síntesis de agar. Esto se debe a que las gotitas no son ecogénicas y no dispersan el ultrasonido. A una potencia ligeramente alta, se generaron algunas microburbujas(Figura 7B)como lo demuestra la aparición de manchas brillantes. A medida que aumentaba la presión, se generaron más microburbujas(Figura 7C y 7D). Esto también demostró que las gotas no se vaporizan espontáneamente a 37 ° C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Figura 1: Imágenes de los pasos para formar la solución pirolipídica al 30%. A) Lípido en polvo más Pyro-SPC en cloroformo. B)Solución de disolución añadida. C)Película lipídica seca y recubierta en la pared interior del vial. D)Vial lipídico envuelto en papel de aluminio (papel de aluminio exterior pegado con cinta adhesiva para su reutilización). E)Solución lipídica hidratada. F)Solución lipídica en vial sérico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Figura 2: El intercambiador de gases de 10 colectores. Las válvulas a las que se hace referencia en el protocolo están etiquetadas. Consulte el archivo complementario "Otros protocolos y datos" para obtener instrucciones sobre cómo ensamblar el intercambiador de gases. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Figura 3: A) Las soluciones lipídicas de las 7 formulaciones (0% a 50% Pyro-SPC) en viales de muestra. Las figuras B a D muestran imágenes de los pasos dados para hacer un 30% de gotas de pirolipídicos. B)Solución pirolipídica al 30% en un vial de muestra. C)Post-agitación. D) Tamaño de 15 min seleccionado. E)Partición inferior transferida al vial de decafluorobutano. D)Post-condensación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Figura 4:Datos de dimensionamiento del contador de coulter (CC) de las muestras de microburbujas y gotas seleccionadas con diferentes contenidos de capa de pirolipídicos(n = 3). Las líneas verdes sólidas representan microburbujas y las líneas cian punteadas representan gotas. A) 0% Piro-SPC. B)1% Piro-SPC. C)10% Piro-SPC. D)20% Piro-SPC. E) 30% Piro-SPC. F)40% Piro-SPC. G)50% Piro-SPC. H) Las concentraciones totales observadas de muestras de microburbujas y gotas del CC basadas en el contenido de Pyro-SPC en la cáscara. Todas las barras de error indican una desviación estándar. Todas las mediciones se realizaron utilizando una apertura de 10 μm que tiene un rango de tamaño de 200 nm a 6000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Figura 5: Mediciones representativas de la absorbancia por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de 300 a 800 nm de la muestra de gotas de pirolipídico al 30% posterior a la condensación diluida en PBS y en tritón al 1%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Figura 6: Emisión de fluorescencia representativa de 600 a 750 nm excitada a 410 nm. A) Muestra de microburbujas pirolipídicas al 30% seleccionadas por tamaño y precondensadas al 1% en Tritón. B)Muestra de gotas de pirolipídicas al 30% post-condensadas en PBS y en Tritón al 1%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Figura 7: Imágenes de ultrasonido representativas de un fantasma de flujo de agar de 37 °C tomadas con un transductor de matriz lineal preclínico de 21 MHz en modo B (ver Tabla de Materiales). La columna izquierda(Figuras A, C, Ey G)muestra los controles de PBS. La columna derecha(Figuras B, D, Fy H)muestra 20 μL de muestra de gotas de pirolipídicas al 30% posteriores a la condensación diluidas en 50 ml de PBS de 37 °C. Cada fila representa las presiones negativas máximas de campo libre, que se estimaron a partir del trabajo realizado por Sheeran et al.8 Los triángulos amarillos indican la profundidad de enfoque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método</td>
			<td>Agente</td>
			<td>Pyro Shell %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Burbujas</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2.76 ± 0.28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8.47 ± 0.95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Burbujas</td>
			<td>Pico [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Burbujas</td>
			<td>Media [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Burbujas</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotas</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1.72 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotas</td>
			<td>Pico [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotas</td>
			<td>Media [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotas</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Estadísticas de datos de dimensionamiento de las muestras de microburbujas y gotas con diferente contenido de Pyro-SPC del Contador de Coulter (CC) (n = 3). Todos los errores indican desviación estándar.
Información complementaria - Hoja de fórmula de lípidos: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información complementaria - Otros protocolos y datos: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

En este protocolo, se describen métodos para sintetizar y caracterizar gotas de porfirina multimodales de cambio de fase.

Síntesis y caracterización de gotas de porfirina de cambio de fase multimodal

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Este protocolo es importante porque proporciona el procedimiento completo para crear gotas desde la película lipídica hasta la solución lipídica, las microburbujas y luego las gotas. La principal ventaja de esta técnica es la simplicidad para condensar microburbujas en gotas. Con solo enfriar y arremolinar, se pueden hacer gotas sin necesidad de presurización.Una demostración visual es crítica porque una prueba simple para ver si las microburbujas se han condensado con éxito es verificando visualmente el cambio en la translucidez. Demostrando el procedimiento estará Kimoon Yoo, un estudiante de maestría en el laboratorio gang Zheng. Usando un decapador, retire el sello de aluminio en el vial de suero y transfiera un mililitro de la solución lipídica a un vial de muestra de vidrio de borosilicato de 1,85 mililitros con una tapa de rosca de fenol dejando que la solución lipídica fluya por la pared interior sin crear burbujas.Con el vial de muestra de 1,85 mililitros, prepárese para que fluya el gas decafluorobutano en el espacio de cabeza del vial de muestra utilizando el intercambiador de gases. Asegúrese de que todas las válvulas del intercambiador de gases estén correctamente cerradas y que la bomba esté apagada. Abra la válvula del colector y desenfunde cuidadosamente la aguja correspondiente del colector.Abra la válvula de presión A y la válvula de presión B y gire la válvula del cilindro de gas aproximadamente de 1/16 a 1/8 en sentido contrario a las agujas del reloj para abrirla parcialmente. Abra la válvula de mango en T y desencabierta el vial de muestra con la solución lipídica. Coloque la aguja del colector sobre la interfaz de aire líquido del vial, gire lentamente la válvula reguladora de aire en el sentido de las agujas del reloj hasta que la aguja del medidor del regulador de aire se mueva ligeramente de su posición de reposo y deje que el gas perfluorocarbono fluya suavemente hacia el espacio de cabeza del vial durante 30 segundos, teniendo cuidado de no crear burbujas.Ajuste la válvula reguladora de aire si es necesario. Después de 30 segundos, mantenga cuidadosa y rápidamente el vial de muestra sin mover demasiado el vial. Tanto la válvula del cilindro de gas, la válvula de mango en T, la válvula del regulador de aire, la válvula de presión A, la válvula de presión B y la válvula del colector.Encinte cuidadosamente la aguja, luego etiquete el vial de muestra y selle el cuello con una película de cera en el sentido de las agujas del reloj. Guarde el vial de muestra en la oscuridad y a cuatro grados centígrados durante al menos 10 minutos o hasta 24 horas. Coloque aproximadamente 100 gramos de hielo seco en un recipiente aislado en el lugar de hielo regular en otro recipiente aislado.Recupere un vial de suero de decafluorobutano previamente preparado a agujas de calibre 20 de 1.5 pulgadas, una jeringa de plástico de un mililitro, un recipiente de 200 mililitros, pinzas de metal y un termómetro. Coloque el vial de muestra con la solución lipídica en el agitador mecánico y agite durante 45 segundos. Debería haber un cambio en el color y la translucidez.Después de la agitación mecánica, colóquelo el vial de muestra del lado derecho hacia arriba protegido de la luz e inicie una cuenta regresiva de 15 minutos para enfriar el vial y seleccionar el tamaño de las microburbujas. Cuando la cuenta regresiva haya alcanzado los 10 minutos, llene un recipiente con aproximadamente 200 mililitros de isopropanol y enfríelo a menos 20 grados centígrados con hielo seco usando pinzas de metal. Después de seleccionar el tamaño de las microburbujas durante 15 minutos, busque la partición de tamaño seleccionada dentro del vial de muestra.Manteniendo el vial de muestra del lado derecho hacia arriba, desencaja cuidadosamente el vial de muestra y retire aproximadamente 0,7 mililitros de la partición inferior con una aguja calibre 20 de 1,5 pulgadas unida a una jeringa de plástico de un mililitro. Asegúrese de que no se retire ninguna de las particiones superiores y no mueva la jeringa para eliminar las bolsas de aire. Apuntando al círculo central en el tapón de goma, inserte una aguja de calibre 20 diferente en un vial de suero de decafluorobutano mientras mantiene la aguja cerca de la parte superior del vial de suero para ventilar y luego inserte la aguja con microburbujas del tamaño seleccionado.Transfiera lentamente el tamaño de las microburbujas seleccionadas. Deje que el líquido se deslice suavemente por la pared interior del vial de suero de decafluorobutano. Una vez que se haya transferido toda la solución de microburbujeo seleccionada del tamaño, retire la aguja con la jeringa, pero mantenga la aguja de ventilación para aliviar la presión negativa.Agregue pequeñas cantidades de hielo seco o isopropanol a temperatura ambiente al baño de isopropanol para asegurarse de que la temperatura del baño esté entre menos 15 y menos 17 grados centígrados. Con la aguja de ventilación de calibre 20 insertada cerca de la parte superior del vial de suero, coloque el vial de suero y el baño de isopropanol, manteniendo el nivel de microburbujas por debajo del nivel del isopropanol, pero el cuello del vial por encima de él y gire intermitentemente el vial de suero durante dos minutos para condensar las microburbujas. No gire el vial de suero continuamente en el isopropanol y no deje que la solución se congele.Gire durante unos cinco segundos y levante el vial de suero fuera del isopropanol. Verifique si hay nucleación de hielo, luego reanude el remolino en isopropanol. Si hay formación de hielo, gire el vial de suero en el aire hasta que se disipe.Después de los dos minutos de condensación, retire el vial de suero del baño de isopropanol y retire la aguja de ventilación. Las microburbujas deben haberse condensado en gotas como lo indica el cambio en la translucidez. Limpie el vial de suero, etiquételo y colóquelo sobre hielo regular en un recipiente con aislamiento oscuro hasta que esté listo para su uso.Las gotas sin abrir con un sello de aluminio intacto deben ser estables hasta por seis horas, siempre y cuando el hielo derretido se reemplace según sea necesario. Cuando esté listo para usar, retire el sello de aluminio con el decapper. Después de usar este protocolo, las microburbujas precondensadas, seleccionadas de tamaño y las gotas postcondensadas se dimensionaron en un contador Coulter con una apertura de 10 micras.Se muestran los datos de dimensionamiento para la formulación de pirolipídicos al 30%. Las estadísticas basadas en los datos de tamaño se muestran aquí. Utilizando una proporción de diámetros medios pre y postcondensados, los resultados mostraron que a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración disminuía y el diámetro medio aumentaba.Se muestran las mediciones absorbentes representativas de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30%. Esto mostró que los ensamblajes intactos tienen diferentes propiedades ópticas reflejadas por diferentes picos en comparación con los componentes lipídicos individuales no ensamblados. Aquí se muestran mediciones de florescencia representativas de la muestra de microburbuja precondensada, gota postcondensada con 30% de pirolípido, que demuestran diferentes picos de fluorescencia para muestras intactas en la forma interrumpida.Se muestran imágenes de ultrasonido representativas de la muestra de gotas de pirolipídico al 30% fotografiadas a diferentes presiones. A bajas presiones, solo se observó señal de fondo de burbujas de aire pegadas de la síntesis de agar. A una potencia ligeramente mayor, se generaron algunas microburbujas, lo que se demuestra por la aparición de manchas brillantes.Se generaron más microburbujas a medida que aumentaba la presión. Es importante recordar que la temperatura de condensación aquí está optimizada para esta formulación específica de la cubierta de gotas. Diferentes formulaciones de cáscara pueden requerir una temperatura diferente.

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