Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro
7 de marzo de 2022
Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.
Las células dendríticas, o CD, son células inmunes clave que unen el sistema inmune innato y adaptativo. Si bien los DC son heterogéneos, este método nos ayuda a comprender qué genes, incluidos los factores de transcripción, pueden regular el desarrollo de DC. Esta técnica proporciona una forma simple y rápida de identificar un gen que controla el desarrollo de DC a partir de su progenitor in vitro.
Para empezar, mantenga las células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas o iHSPC en medio RPMI 1640 completo, complementado con 100 nanogramos por mililitro del ligando FLT3 y un beta estradiol micromolar. Para la transducción lentiviral, coloque las iHSPC en placas de 12 pocillos a una densidad de una vez 10 a la quinta célula por pocillo y un mililitro de medio completo que contenga el ligando FLT3, beta estradiol y polibreno. Luego, agregue el lentivirus que lleva el ARN de horquilla corta en cada pozo a una multiplicidad de infección de 100.
A continuación, gire la placa a 1100 veces g y 37 grados Celsius durante 90 minutos, luego incube las células infectadas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, retire el polibreno recolectando las células en tubos de 15 mililitros en centrifugación, luego reemplace el medio con un medio completo fresco que contenga el ligando FLT3 y el beta estradiol. Después de 24 horas adicionales, agregue seis microgramos por mililitro de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas.
Reemplace el medio de selección cada tres días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir los iHSPC transducidos de manera estable. Generar y mantener iHSPC de derribo estables para LacZ, Tcf4 e Id2 en medio completo suplementado con el ligando FLT3 y beta estradiol. Para iniciar la diferenciación in vitro, recoja los iHSPC indiferenciados en tubos de 15 mililitros y gule las células por centrifugación.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un medio completo que contenga solo el ligando FLT3 y luego sembrarlas a una densidad de dos veces 10 a la quinta venta por mililitro en una placa de 12 pocillos. Después de tres días, agregue un mililitro de medio completo fresco que contenga el ligando FLT3.
Después de dos días adicionales, proceda a analizar las células diferenciadas por citometría de flujo. Para el análisis citométrico de flujo, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces en la placa y luego recoja las células en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar las celdas en 50 microlitros de búfer de fax.
A continuación, agregue 50 microlitros de anti-CD16 por 32 hibridoma sobrenadante e incube durante cinco a 10 minutos en hielo. Luego, agregue anticuerpos conjugados con colorante fluorescente directamente a las células e incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de fax y centrifugue la muestra.
Después de la centrifugación, resuspend las células en 100 microlitros de tampón de fax y analizar las muestras por citometría de flujo. Después de un corto knockdown mediado por ARN de la horquilla de LacZ, Tcf4 e Id2 en iHSPCS, la confirmación de la eficiencia de knockdown por RTQ-PCR mostró que la expresión de los iHSPC de knockdown de Tcf4 y Tcf4 se redujo en comparación con la de los iHSPC de knockdown de LacZ. Se observaron resultados similares para la expresión de Id2 en los iHSPC de derribo de Id2.
Después de cultivar iHSPC de derribo de LacZ durante cinco días, la frecuencia de células CD11c positivas, que representan la población de células dendríticas, fue de alrededor del 95%. Un análisis adicional de las células dendríticas CD11c positivas derivadas de los iHSPC de derribo de LacZ reveló que el 70% eran células dendríticas convencionales, mientras que el 22% eran células dendríticas plasmocitoides. Los iHSPC de derribo Tcf4 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas plasmocitoides que controla el derribo de LacZ.
En contraste, los iHSPC de derribo Id2 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas convencionales que los controles de derribo de LacZ, pero un mayor porcentaje de células dendríticas plasmocitoides. Las infecciones por espín aumentan la eficiencia de transducción del shRNA portador de lentivirus en los iHSPC. Esta técnica aborda el papel de los factores de transcripción y facilita el estudio de otros genes en la transducción o metabolismo de señalización de citoquinas, que probablemente estén involucrados en el desarrollo de DC.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la selección de factores de transcripción que influyen en el desarrollo de las células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA. El método permite la creación de líneas celulares con silenciamiento estable para la diferenciación in vitro de células DC.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Regulación Transcripcional
Antecedentes
- Las células dendríticas son cruciales para vincular la inmunidad innata y adaptativa.
- Comprender el desarrollo de las CD puede revelar información sobre las respuestas inmunitarias.
- Este estudio se centra en identificar los genes que regulan la diferenciación de las CD.
- El método utiliza células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la selección de factores de transcripción en el desarrollo de las células dendríticas.
- Crear líneas celulares con silenciamiento estable para estudios funcionales.
- Facilitar la diferenciación in vitro de células dendríticas a partir de células progenitoras.
Métodos Utilizados
- Mantenimiento de iHSPC en medio RPMI 1640 completo.
- Suplementación con ligando FLT3 y beta-estradiol.
- Transducción lentiviral de iHSPC con shRNA.
- Uso de polibreno para mejorar la eficiencia de transducción.
Resultados principales
- Generación exitosa de líneas celulares con silenciamiento estable.
- Identificación de factores de transcripción implicados en el desarrollo de las células dendríticas.
- Demuestra las capacidades de diferenciación in vitro.
- Conocimientos sobre la regulación génica del desarrollo de células inmunitarias.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar el desarrollo de las DC.
- Puede utilizarse para identificar genes reguladores clave en inmunología.
- Este enfoque podría mejorar la comprensión de las respuestas inmunitarias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la interrogación sistemática de la función de los factores de transcripción en la determinación de la linaje de células dendríticas, apoyando la validación de objetivos en programas de descubrimiento centrados en inmunología. Al vincular la perturbación genética con el resultado fenotípico en un sistema in vitro reproducible, proporciona una desvinculación mecanicista para hipótesis iniciales sobre objetivos. El enfoque mejora la confianza predictiva en la priorización de objetivos inmunomoduladores antes de los esfuerzos intensivos en recursos para la identificación de candidatos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de factores de transcripción como posibles objetivos terapéuticos en el desarrollo de células dendríticas.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma escalable para cribado por silenciamiento mediante la entrega de ARNip lentivirales en progenitores hematopoyéticos inmortalizados.
- Valor predictivo: Relaciona la modulación del objetivo con el resultado de subpoblaciones de células dendríticas, apoyando decisiones de avance o interrupción basadas en datos de desviación de linaje.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas por citometría de flujo de células positivas para CD11c y distribución de subpoblaciones (cDC frente a pDC) tras el silenciamiento del factor de transcripción.
- Valor operativo: Establece un ensayo estandarizado de diferenciación con condiciones definidas de citocinas (ligando FLT3, betaestradiol) y selección mediante puromicina.
- Preparación del ensayo: Produce líneas celulares con silenciamiento estable, adecuadas para su uso repetido en estudios de cribado de compuestos o modulación de vías.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor traslacional: Modela la especificación temprana de células dendríticas a partir de progenitores, aportando información para estrategias de biomarcadores vinculadas a redes de factores de transcripción.
- Reducción mecanicista de riesgos: Clarifica el papel de Id2 en la promoción del destino de células dendríticas convencionales y de Tcf4 en el desarrollo de células dendríticas plasmocitoides.
- Alineación preclínica: Facilita la evaluación de dianas que influyen en la diferenciación de células inmunitarias, relevante para programas de adyuvantes vacunales o autoinmunidad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se enmarca en la fase de biología de descubrimiento, permitiendo la verificación de hipótesis sobre dianas antes del desarrollo de ensayos para la identificación de compuestos activos, con datos que orientan la selección de candidatos preclínicos en inmunomodulación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la disección mecanicista de los reguladores transcripcionales que gobiernan el compromiso de la línea celular de células dendríticas a partir de precursores hematopoyéticos.
- Desarrollo de Ensayos: Genera puntos finales reproducibles y cuantitativos mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo para monitorear la eficiencia de diferenciación y la distribución de subpoblaciones.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantificables (porcentaje de CD11c+, cDC, pDC) que permiten comparaciones entre condiciones de silenciamiento y respaldan la evaluación estadística del impacto del blanco.
- Investigación Traslacional: Conecta la diferenciación de precursores tempranos con la función inmune posterior, relevante para modelar respuestas en contextos de infección o tolerancia.
- Uso Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para cribar genes adicionales en redes de señalización de citoquinas, metabolismo o regulación transcripcional que afecten el desarrollo de células dendríticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al vincular la inhibición del factor de transcripción con cambios medibles en la generación de subpoblaciones de células dendríticas.
- Valor operativo: Permite la estandarización de protocolos de diferenciación y lectura entre laboratorios mediante condiciones definidas de medio y marcadores de selección.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la selección de blancos inmunomoduladores al proporcionar evidencia funcional temprana de efectos específicos de linaje.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo de blancos según su influencia en las decisiones de destino celular de las células dendríticas, favoreciendo una asignación eficiente de recursos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transducción con lentivirus, cultivo de células hematopoyéticas y citometría de flujo.
- Depende del acceso a bibliotecas de ARNip con lentivirus, selección con puromicina y medios suplementados con citocinas (ligando FLT3, estradiol beta).
- Necesita la estandarización de la eficiencia de transducción (por ejemplo, mediante infección por centrifugación) y la duración de la selección para generar un silenciamiento estable.
- Implica la optimización del momento de diferenciación y de los paneles de anticuerpos para identificar con precisión los subconjuntos de células dendríticas mediante citometría de flujo.
- Se limita a modelos in vitro; los hallazgos requieren validación en sistemas primarios humanos o murinos para tener relevancia traslacional.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
