Name: Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a estudiar el desarrollo de células dendríticas mediante transducción lentiviral con ARN de horquilla corta en células progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas. Este método permite generar líneas con knockdown estable para identificar factores de transcripción clave en la diferenciación in vitro.

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Agradecemos el apoyo técnico del Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos a la Instalación Central Nacional de ARNi (Academia Sinica, Taiwán) por proporcionar lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 y MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

El manejo del lentivirus se realiza según la regulación del Departamento de Salud y Seguridad Ambiental de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Taiwán.
1. Preparación de líneas celulares madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPC)
<ol><li>Mantener la línea celular iHSPC en medio RPMI 1640 completo que contenga 100 ng/mL FL y 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Pase las células en una proporción de 1:10 cada 3 días. NOTA: Haga un medio RPMI 1640 completo complementando con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 5 x 10-5 M de β-mercaptoetanol y 10 μg / ml de gentamicina. La FL murina recombinante también está disponible comercialmente.</li>
</ol>2. Transducción lentiviral
<ol><li>Placa iHSPC a una densidad de 1 x 105 células/pozo en placas de 12 pocillos en 1 mL de medio completo que contiene 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol y 8 μg/mL de polibreno. NOTA: La concentración de polibreno depende de los tipos de células y generalmente está en el rango de 4-8 μg / ml.</li>
	<li>Agregue el lentivirus portador de shRNA en cada pocillo a una multiplicidad de infección (MOI) de 100. NOTA: El vector lentiviral es pLKO.1-Puro con un marcador de selección de puromicina (Figura 1). Las secuencias objetivo de shRNAs contra LacZ, Tcf4 e Id2, respectivamente, se enumeran en la Tabla de Materiales. El MOI se define por el número de viriones que se agregan por célula durante la infección. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg">
</li>
	<li>Girar las placas a 1.100 x g durante 90 min a 37 °C. NOTA: La infección de giro se lleva a cabo utilizando un rotor de cucharón oscilante.</li>
	<li>Incubar la placa que contiene las células infectadas durante la noche a 37 °C en una incubadora. NOTA: Si las células son sensibles al polibreno, actualice las células con el medio completo sin polibreno después de la infección por espín.</li>
	<li>Refrescar las células con un medio completo que contenga 100 ng/ml fl y 1 μM β-estradiol 24 h después de la infección.</li>
	<li>Agregue 6 μg/ml de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas después de 24 h adicionales. NOTA: El vector lentiviral transducido generalmente tarda 48 h en expresar genes, incluido el gen resistente a la puromicina. Asegúrese de que la concentración de puromicina esté optimizada para cada línea celular.</li>
	<li>Actualice el medio de selección que contiene 100 ng / ml FL, 1 μM β-estradiol y 6 μg / ml de puromicina cada 3 días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir las células iHSPC transducidas de manera estable. NOTA: La selección de puromicina generalmente surte efecto 48 h más tarde, y el período de selección depende de los tipos de células.</li>
</ol>3. Medición de la eficiencia de derribo mediante transcripción inversa y PCR en tiempo real (RT-PCR)
<ol><li>Extraiga el ARN total de 1 x 107 células iHSPC de derribo estables shLacZ, shTcf4 y shId2 utilizando un reactivo de extracción de ARN comercial y precipite EL ARN de la capa acuosa con isopropanol, seguido de lavar el precipitado de ARN con etanol al 75%.</li>
	<li>Disolver el ARN (~ 5 μg) con 5 μL de H2O tratado con DEPC y ajustar la concentración a 1 μg/μL.</li>
	<li>Tomar 1-3 μg de ARN, mezclar con H2O tratado con DEPC hasta un volumen final de 17,4 μL, añadir 1 μL de 1 unidad/μL de DNasa I libre de RNasa e incubar durante 20 min a 37 °C. NOTA: Este paso consiste en digerir el ADN genómico en las muestras de ARN.</li>
	<li>Añadir 1 μL de 20 mM de EDTA a las muestras de ARN, incubar a 65 °C durante 10 min para inactivar la DNasa I, y colocar las muestras de ARN inmediatamente a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 11,6 μL de la mezcla de reacción que contiene 1 μL de cebadores oligo (dT) (45 μM), 6 μL de tampón de 5x 1ª hebra, 3 μL de dNTP (2 mM), 0,6 μL de inhibidor de la RNasa (50 Unidad/μL) y 1 μL de transcriptasa inversa (200 Unidad/μL) a las muestras de ARN e incubar a 40 °C durante 1 h.</li>
	<li>Detenga la reacción calentando a 70 °C durante 10 min y diluya la mezcla de reacción con 30 μL de H2O.</li>
	<li>Tome 2 μL de la mezcla de reacción RT diluida como una plantilla de ADN y la PCR la amplifique utilizando cebadores contra Tcf4 o Id2 (consulte la Tabla 1 para las condiciones del termociclador). NOTA: Las secuencias de imprimación se incluyen en la Tabla de Materiales.</li>
</ol>4. Diferenciación in vitro de las líneas celulares iHSPC de derribo estable
<ol><li>Mantener el knockdown único estable de LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) o Id2 (shId2) en iHSPC en medio completo que contenga 100 ng/mL de FL y 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Recolecte los iHSPC no diferenciados shLacZ, shTcf4 y shId2 en un tubo de 15 ml y centrífuga durante 5 minutos a 500 x g para granular las células.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y agregue 10 ml de PBS para lavar las células. Repita este paso dos veces.</li>
	<li>Resuspend y sembra las células iHSPC a una densidad de 2 x 105 células/ml en una placa de 12 pocillos en 1 mL de medio completo que contenga 100 ng/mL FL solamente.</li>
	<li>Agregue 1 ml de medio completo fresco que contenga 100 ng/ ml FL tres días después.</li>
	<li>Analizar las células diferenciadas (shLacZ, shTcf4 y shId2 iHSPCs) mediante citometría de flujo dos días después.</li>
</ol>5. Análisis citométrico de flujo de los DC diferenciados
<ol><li>Recolecte las células en tubos de 1,5 ml mediante el pipeteo de las celdas hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces en la placa, y centrífuga durante 5 minutos a 500 x g a temperatura ambiente (RT). NOTA: Los DC diferenciados in vitro se unirán ligeramente a las placas. El pipeteo suave ayudará a recuperar los DC de las placas.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 50 μL de tampón FACS. A continuación, agregue 50 μL de sobrenadante de hibridoma anti-CD16/32 e incube durante 5-10 minutos en hielo. NOTA: El anticuerpo bloqueador Fc previene la unión inespecífica de anticuerpos a los receptores Fc que se expresan en algunas células mieloides y células B y está disponible comercialmente a través de varios proveedores.</li>
	<li>Agregue anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes (0,04 μg por cada anticuerpo) directamente a las células e incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Los anticuerpos utilizados son APC/cy7 anti-ratón CD11c, FITC anti-ratón CD11b, y PE anti-ratón B220. NOTA: Los pDC se definen como CD11c+CD11b-B220+, y los cDC se definen como CD11c+CD11b+B220-.</li>
	<li>Lavar las células con 1 ml de tampón FACS y centrífuga durante 5 min a 500 x g a RT.</li>
	<li>Resuspendir las células en 100 μL de tampón FACS y analizarlas por citometría de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
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<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los vectores de ARNt sh basados en lentivirus se utilizan a menudo para el silenciamiento de genes por transducción viral en las células y permiten una integración estable en el genoma del huésped. Sin embargo, es necesario considerar varias eficiencias de transducción en diferentes tipos de células, y se han adoptado varios enfoques para superar este problema. 
El polibreno es un polímero policatiónico que puede neutralizar las cargas en la membrana celular, mejorando así la unión del virión ...

Los DC son reguladores clave de la inmunidad innata y adaptativa1. Los DC se clasifican principalmente en dos poblaciones funcionalmente distintas, a saber, pDC y CDC. Además, los cDC comprenden dos subconjuntos, a saber, los cDC de tipo I y tipo II o cDC1 y cDC2, respectivamente2. Los pDC, que expresan BST2, Siglec-H y niveles intermedios de CD11c en ratones3,4, son las células que pueden secretar grandes cantidades de IFN-I durante la inflamación y la infección viral5. Debido a su robusta capacidad de producción de IFN-I, también se sospecha que desempeñan un papel clave en la progresión de enfermedades autoinmunes, incluido el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los cDC1s, definidos por la expresión superficial de XCR1, CD8a, CLEC9A y CD103 en ratones7, están especializados en la activación y polarización de células T citotóxicas CD8+ (CTL) a través de la presentación cruzada de antígenos, iniciando así la inmunidad tipo I en respuesta a patógenos intracelulares y cáncer8,9. Por otro lado, los cDC2s, que expresan CD11b y CD172α (también conocidos como Sirpα) tanto en humanos como en ratones, pueden activar las células T CD4+ y promover la respuesta inmune tipo II frente a alérgenos y parásitos10, así como modular la inmunidad tipo III tras el reconocimiento extracelular de bacterias y microbiota11,12.
La diversificación de los DC está determinada por un grupo de TF a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en el BM. E2-2 (codificado por Tcf4) es un regulador maestro para la diferenciación y función de los pDC13,14. Por el contrario, el inhibidor de la unión al ADN 2 (ID2) impulsa la especificación de cDC e inhibe el desarrollo de pDC a través del bloqueo de la actividad de la proteína E15. Además, el desarrollo de cDC1 requiere IRF8 y BATF3, mientras que la diferenciación de cDC2 depende en gran medida de IRF416. Trabajos recientes han explorado la heterogeneidad de los pDCs17 y cDCs y su regulación transcripcional18. Debido a la complejidad de la red de CC, existe una necesidad insatisfecha de establecer una plataforma para identificar otros TF que controlen el desarrollo y la funcionalidad de los CONTROLADORES.
Aquí, utilizamos un iHSPC que se generó al expresar la translocación nuclear regulada por estrógenos de Hoxb8 en células BM (también conocidas como células Hoxb8-FL)19. Los iHSPC pueden proliferar y permanecer en una etapa indiferenciada en presencia de β-estradiol y ligando Flt3 (FL), mientras que comienzan a diferenciarse en diferentes tipos de DC en presencia de FL al retirar β-estradiol19. Sobre la base de esta característica, podemos derribar genes de interés en la etapa progenitora, seguido de examinar el efecto sobre la diferenciación in vitro de pDC y cDC. Por lo tanto, este método es una herramienta poderosa para descubrir los genes que regulan el desarrollo y la función de los DC.

<table><tbody><tr><td><Anticuerpos > fuertes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-ratón Anticuerpo CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(Clon: N418)</td></tr><tr><td>FITC anti-ratón/humano Anticuerpo CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(Clon: M1/70)</td></tr><tr><td>PE anti-ratón/humano Anticuerpo B220</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>(Clon: RA3-6B2)</td></tr><tr><td><fuerte>Cultivo celular</ fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Micro tubo</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa tratada con cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tampón FACS</td> hecho <td>en</td><td></td> casa <td>Fórmula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td></tr><tr><td>Flt3 ligando (FL)</td><td>casero</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (secuencia de Taregt/ID de clon)</td><td>Empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>El Consorcio de ARNi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>El Consorcio de ARNi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>El Consorcio de ARNi (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por arn de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Las células dendríticas (DC) son importantes células presentadoras de antígenos que conectan las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los DC son heterogéneos y se pueden dividir en DC convencionales (cDC) y DC plasmocitoides (pDC). Los cDC se especializan en presentar antígenos y activar células T naïve. Por otro lado, los pDC pueden producir grandes cantidades de interferones tipo I (IFN-I) durante la infección viral. La especificación de los DC ocurre en una etapa temprana de los progenitores de DC en la médula ósea (BM) y se define por una red de factores de transcripción (TF). Por ejemplo, los cDC expresan altamente ID2, mientras que los pDC expresan altamente E2-2. Dado que se están identificando cada vez más subconjuntos de DC, existe un creciente interés en comprender los TF específicos que controlan el desarrollo de DC. Aquí, establecemos un método para detectar TF críticos para la diferenciación de DC in vitro mediante la entrega de lentivirus portadores de ARN de horquilla corta (shRNA) en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPC). Después de la selección y diferenciación in vitro , el potencial cDC y pDC de las líneas celulares de derribo estable se analiza mediante citometría de flujo. Este enfoque proporciona una plataforma para identificar genes que potencialmente gobiernan los destinos de DC de progenitores in vitro.

Se muestra el mapa del vector lentiviral pLKO.1-Puro (Figura 1). Después de la administración de lentivirus que expresa shRNA contra LacZ (un control no dirigido), Tcf4 e Id2 en iHSPC, la eficiencia de derribo confirmada por RT-qPCR reveló que la expresión de Tcf4 se redujo en shTcf4 iHSPCs, en comparación con shLacZ iHSPCs (Figura 2A). Por otro lado, también se observó la disminución de la expresión de I...

Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Las células dendríticas, o CD, son células inmunes clave que unen el sistema inmune innato y adaptativo. Si bien los DC son heterogéneos, este método nos ayuda a comprender qué genes, incluidos los factores de transcripción, pueden regular el desarrollo de DC. Esta técnica proporciona una forma simple y rápida de identificar un gen que controla el desarrollo de DC a partir de su progenitor in vitro.Para empezar, mantenga las células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas o iHSPC en medio RPMI 1640 completo, complementado con 100 nanogramos por mililitro del ligando FLT3 y un beta estradiol micromolar. Para la transducción lentiviral, coloque las iHSPC en placas de 12 pocillos a una densidad de una vez 10 a la quinta célula por pocillo y un mililitro de medio completo que contenga el ligando FLT3, beta estradiol y polibreno. Luego, agregue el lentivirus que lleva el ARN de horquilla corta en cada pozo a una multiplicidad de infección de 100.A continuación, gire la placa a 1100 veces g y 37 grados Celsius durante 90 minutos, luego incube las células infectadas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, retire el polibreno recolectando las células en tubos de 15 mililitros en centrifugación, luego reemplace el medio con un medio completo fresco que contenga el ligando FLT3 y el beta estradiol. Después de 24 horas adicionales, agregue seis microgramos por mililitro de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas.Reemplace el medio de selección cada tres días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir los iHSPC transducidos de manera estable. Generar y mantener iHSPC de derribo estables para LacZ, Tcf4 e Id2 en medio completo suplementado con el ligando FLT3 y beta estradiol. Para iniciar la diferenciación in vitro, recoja los iHSPC indiferenciados en tubos de 15 mililitros y gule las células por centrifugación.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un medio completo que contenga solo el ligando FLT3 y luego sembrarlas a una densidad de dos veces 10 a la quinta venta por mililitro en una placa de 12 pocillos. Después de tres días, agregue un mililitro de medio completo fresco que contenga el ligando FLT3.Después de dos días adicionales, proceda a analizar las células diferenciadas por citometría de flujo. Para el análisis citométrico de flujo, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces en la placa y luego recoja las células en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar las celdas en 50 microlitros de búfer de fax.A continuación, agregue 50 microlitros de anti-CD16 por 32 hibridoma sobrenadante e incube durante cinco a 10 minutos en hielo. Luego, agregue anticuerpos conjugados con colorante fluorescente directamente a las células e incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de fax y centrifugue la muestra.Después de la centrifugación, resuspend las células en 100 microlitros de tampón de fax y analizar las muestras por citometría de flujo. Después de un corto knockdown mediado por ARN de la horquilla de LacZ, Tcf4 e Id2 en iHSPCS, la confirmación de la eficiencia de knockdown por RTQ-PCR mostró que la expresión de los iHSPC de knockdown de Tcf4 y Tcf4 se redujo en comparación con la de los iHSPC de knockdown de LacZ. Se observaron resultados similares para la expresión de Id2 en los iHSPC de derribo de Id2.Después de cultivar iHSPC de derribo de LacZ durante cinco días, la frecuencia de células CD11c positivas, que representan la población de células dendríticas, fue de alrededor del 95%. Un análisis adicional de las células dendríticas CD11c positivas derivadas de los iHSPC de derribo de LacZ reveló que el 70% eran células dendríticas convencionales, mientras que el 22% eran células dendríticas plasmocitoides. Los iHSPC de derribo Tcf4 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas plasmocitoides que controla el derribo de LacZ.En contraste, los iHSPC de derribo Id2 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas convencionales que los controles de derribo de LacZ, pero un mayor porcentaje de células dendríticas plasmocitoides. Las infecciones por espín aumentan la eficiencia de transducción del shRNA portador de lentivirus en los iHSPC. Esta técnica aborda el papel de los factores de transcripción y facilita el estudio de otros genes en la transducción o metabolismo de señalización de citoquinas, que probablemente estén involucrados en el desarrollo de DC.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

En este video, demostramos un método para realizar la transducción de vectores lentivirales de shRNA para obtener líneas celulares knockdown estables en células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPCs).

Knockdown de genes mediados por ARN de horquilla corta en iHSPCs in vitro: un sistema de expresión de shRNA basado en lentivirus que se entrega en iHSPCs para la eliminación de la expresión de genes específicos

Este video muestra un ensayo in vitro para generar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfoides comunes (CLPs). Al cocultivar CLPs purificadas con células alimentadoras irradiadas con γ en presencia de ligando (FL) de tirosina quinasa-3 similar a Fms, las CLP se diferencian en pDC no adherentes, cuya presencia se confirma mediante citometría de flujo.

Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes

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Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

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Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Aprenda a estudiar el desarrollo de células dendríticas mediante transducción lentiviral con ARN de horquilla corta en células progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas. Este método permite generar líneas con knockdown estable para identificar factores de transcripción clave en la diferenciación in vitro.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro (Video) | JoVE Journal

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

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