Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Las células dendríticas, o CD, son células inmunes clave que unen el sistema inmune innato y adaptativo. Si bien los DC son heterogéneos, este método nos ayuda a comprender qué genes, incluidos los factores de transcripción, pueden regular el desarrollo de DC. Esta técnica proporciona una forma simple y rápida de identificar un gen que controla el desarrollo de DC a partir de su progenitor in vitro.

Para empezar, mantenga las células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas o iHSPC en medio RPMI 1640 completo, complementado con 100 nanogramos por mililitro del ligando FLT3 y un beta estradiol micromolar. Para la transducción lentiviral, coloque las iHSPC en placas de 12 pocillos a una densidad de una vez 10 a la quinta célula por pocillo y un mililitro de medio completo que contenga el ligando FLT3, beta estradiol y polibreno. Luego, agregue el lentivirus que lleva el ARN de horquilla corta en cada pozo a una multiplicidad de infección de 100.

A continuación, gire la placa a 1100 veces g y 37 grados Celsius durante 90 minutos, luego incube las células infectadas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, retire el polibreno recolectando las células en tubos de 15 mililitros en centrifugación, luego reemplace el medio con un medio completo fresco que contenga el ligando FLT3 y el beta estradiol. Después de 24 horas adicionales, agregue seis microgramos por mililitro de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas.

Reemplace el medio de selección cada tres días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir los iHSPC transducidos de manera estable. Generar y mantener iHSPC de derribo estables para LacZ, Tcf4 e Id2 en medio completo suplementado con el ligando FLT3 y beta estradiol. Para iniciar la diferenciación in vitro, recoja los iHSPC indiferenciados en tubos de 15 mililitros y gule las células por centrifugación.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un medio completo que contenga solo el ligando FLT3 y luego sembrarlas a una densidad de dos veces 10 a la quinta venta por mililitro en una placa de 12 pocillos. Después de tres días, agregue un mililitro de medio completo fresco que contenga el ligando FLT3.

Después de dos días adicionales, proceda a analizar las células diferenciadas por citometría de flujo. Para el análisis citométrico de flujo, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces en la placa y luego recoja las células en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar las celdas en 50 microlitros de búfer de fax.

A continuación, agregue 50 microlitros de anti-CD16 por 32 hibridoma sobrenadante e incube durante cinco a 10 minutos en hielo. Luego, agregue anticuerpos conjugados con colorante fluorescente directamente a las células e incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de fax y centrifugue la muestra.

Después de la centrifugación, resuspend las células en 100 microlitros de tampón de fax y analizar las muestras por citometría de flujo. Después de un corto knockdown mediado por ARN de la horquilla de LacZ, Tcf4 e Id2 en iHSPCS, la confirmación de la eficiencia de knockdown por RTQ-PCR mostró que la expresión de los iHSPC de knockdown de Tcf4 y Tcf4 se redujo en comparación con la de los iHSPC de knockdown de LacZ. Se observaron resultados similares para la expresión de Id2 en los iHSPC de derribo de Id2.

Después de cultivar iHSPC de derribo de LacZ durante cinco días, la frecuencia de células CD11c positivas, que representan la población de células dendríticas, fue de alrededor del 95%. Un análisis adicional de las células dendríticas CD11c positivas derivadas de los iHSPC de derribo de LacZ reveló que el 70% eran células dendríticas convencionales, mientras que el 22% eran células dendríticas plasmocitoides. Los iHSPC de derribo Tcf4 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas plasmocitoides que controla el derribo de LacZ.

En contraste, los iHSPC de derribo Id2 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas convencionales que los controles de derribo de LacZ, pero un mayor porcentaje de células dendríticas plasmocitoides. Las infecciones por espín aumentan la eficiencia de transducción del shRNA portador de lentivirus en los iHSPC. Esta técnica aborda el papel de los factores de transcripción y facilita el estudio de otros genes en la transducción o metabolismo de señalización de citoquinas, que probablemente estén involucrados en el desarrollo de DC.