Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN

La importancia de este protocolo es que proporciona un medio para mantener funcionales los sensores codificados por ADN mediante la inmovilización de plantillas de plásmidos de ADN en microcápsulas biocompatibles semipermeables. La técnica de inmovilización de ADN propuesta es versátil. Permite la fabricación de biosensores multifuncionales con diferentes mecanismos de activación in vitro.

Imaginamos que estas microcápsulas, junto con los elementos de detección adecuados, podrían usarse para estudiar diferentes procesos biológicos, incluida la liberación de moléculas de señalización en diferentes entornos, como biopelículas y órganos. Esta técnica puede proporcionar información sobre los sistemas biológicos a microescala, en particular cómo la inmovilización del ADN y la aglomeración molecular pueden afectar la cinética y el mecanismo de activación de los genes. Comience con la deposición de la capa principal de polietileneimina sobre las micropartículas de sílice de sacrificio, o SiO2, agregando un mililitro de solución de polietileno a 300 microlitros de las micropartículas en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Agite la mezcla en un ThermoMixer a 800 rotaciones por minuto en condiciones ambientales. Recoja las micropartículas por centrifugación a 0,2 g durante un minuto a temperatura ambiente y retire con cuidado el sobrenadante. Después de 15 minutos, lavar las micropartículas cuatro veces con un mililitro de agua desionizada libre de DNasa y RNasa por centrifugación a 0,2 g durante un minuto a temperatura ambiente, desechando el sobrenadante después de cada centrifugación.

A continuación, ajuste la concentración de plásmidos de ADN de 50 a 200 nanogramos por microlitros con agua destilada libre de DNasa y RNasa, y use un mililitro de las soluciones preparadas para depositar el ADN en las micropartículas preparadas con polietileneimina. Agite suavemente la mezcla de micropartículas en un ThermoMixer a cuatro grados centígrados y 800 rpm durante 15 minutos, y luego recoja las micropartículas por centrifugación a 0,2 g durante un minuto. Marque los tubos para los plásmidos de ADN que codifican riboswitch de teofilina, junto con GFPa1 como ThyRS-GFPa1, y los plásmidos de ADN que codifican aptámero de brócoli como BrocApt.

Retire con cuidado el sobrenadante y lave las micropartículas cuatro veces con un mililitro de agua destilada libre de DNasa y RNasa como se demostró anteriormente, desechando el sobrenadante después de cada centrifugación. Para depositar la capa de fibroína de seda, agregue un mililitro de la solución acuosa de fibroína de seda reconstituida a las micropartículas absorbidas por el ADN y agite suavemente la mezcla en el ThermoMixer a 750 rpm durante 15 minutos a 10 grados centígrados. Recoja las micropartículas por centrifugación y luego lávelas una vez con un mililitro de agua destilada libre de DNasa y RNasa, como se explicó anteriormente.

Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Añadir 0,5 mililitros de agua destilada de DNasa y RNasa, y mezclar las micropartículas por vórtice. A continuación, trate las micropartículas con 0,5 mililitros de metanol al 100% a 10 grados centígrados durante cinco minutos en un ThermoMixer.

Después de recolectar las micropartículas por centrifugación, trate las partículas con metanol al 100% en el ThermoMixer a 750 rotaciones por minuto durante 10 minutos a 10 grados Celsius para la formación de hojas beta. Centrifugar la mezcla a 0,2 g durante un minuto a cuatro grados centígrados para recoger las micropartículas antes de lavarlas dos veces con un mililitro de agua destilada sin DNasa y RNasa, como se ha demostrado anteriormente. Disuelva los núcleos de SiO2 de las micropartículas agregando una solución de ácido fluorhídrico al 8% a las micropartículas de la cubierta del núcleo granulado.

Transfiera las soluciones de partículas disueltas a los dispositivos de diálisis y dialícelas contra el agua desionizada en un vaso de precipitados. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para recoger la suspensión de microcápsulas de seda de los dispositivos de diálisis en nuevos tubos de microcentrífuga de dos mililitros. Transfiera 100 microlitros de la muestra de microcápsula a un solo pocillo de portaobjetos de vidrio de ocho pocillos y deje que las cápsulas se sedimenten durante 20 a 30 minutos antes de obtener imágenes con un microscopio de escaneo láser confocal o CLSM.

Pipetear 100 microlitros de la suspensión de cápsulas en cada pocillo de un portaobjetos de vidrio con cámara. A cada pocillo, agregue secuencialmente 300 microlitros de la solución de fluoróforo de diferentes pesos moleculares desde el más bajo hasta el más alto. Mezcle la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y deje que la mezcla se incube durante una hora a temperatura ambiente hasta que la difusión de las soluciones de fluoróforos alcance el equilibrio.

Más tarde, transfiera el portaobjetos a un CLSM para obtener imágenes de cada pozo utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros. Identifique el área de interés ajustando el plano focal y concéntrese en las cápsulas que aparecen en forma de círculos de mayor diámetro. Realizar una reacción de transcripción/traducción in vitro añadiendo secuencialmente los componentes libres de células a una muestra de microcápsulas e incubando el tubo a 30 grados centígrados durante cuatro horas.

Compruebe la fluorescencia en un lector de placas utilizando una longitud de onda de excitación a 488 nanómetros y la emisión para el filtro GFP/FITC a unos 510 nanómetros. Por último, visualice las microcápsulas de seda en el sistema CLSM utilizando láseres a 488 y 561 nanómetros. En el estudio, se produjeron microcápsulas robustas de fibroína de seda con un tamaño homogéneo de alrededor de 4,5 micrómetros y un grosor de cáscara de aproximadamente 500 nanómetros.

La permeabilidad de las cápsulas huecas de fibroína de seda se analizó siguiendo el método de corte de peso molecular. Un aumento en la concentración de una capa principal de polietileno conduce a una mayor estabilidad coloidal de las microcápsulas con cubiertas más permeables, mientras que la eliminación de la capa principal provoca la agregación de cápsulas con membranas de carcasa menos permeables. La cinética de expresión de GFPa1 durante la activación de ThyRS reveló una mayor activación del gen GFPa1 a partir de plásmidos de ADN cargados en microcápsulas de seda que el ADN no encapsulado de control.

En el análisis representativo, se muestran imágenes CLSM de cápsulas de fibroína de seda cargadas con 32 copias de ADN por cápsula antes y después de la incubación en el sistema de transcripción in vitro, traducción. Los perfiles de intensidad transversal de las cápsulas de fibroína de seda demostraron la expresión de GFPa1. La cinética de transcripción de 20 microcápsulas de seda en capas cargadas con 30 copias de ADN por cápsula se comparó con el ADN no encapsulado de control.

La mayor señal de salida de las microcápsulas de seda que las muestras de ADN no encapsuladas de concentraciones equivalentes confirmó la eficacia de las microcápsulas de seda. Siguiendo este protocolo, se pueden aplicar varias técnicas de microscopía de alta resolución para obtener imágenes del entrelazamiento del ADN en estado inmovilizado y del proceso de activación de genes desacoplados in vitro. Esta técnica se puede aplicar para responder a la dinámica a nivel molecular en células artificiales mínimas.

Específicamente, cuando se combinan con los elementos genéticos adecuados, las microcápsulas se pueden usar para estudiar la comunicación de célula a célula.