Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Es un protocolo simple y rápido que permite a las personas que no están familiarizadas con las cianobacterias aislar el ficobilisoma a gusto. La ventaja de esta técnica es que se adapta a pequeña escala y es fácil de realizar. Es un método simple, confiable y eficiente para aislar ficobilisomas intactos de cinobacterias modelo y no modelo.

Comience transfiriendo el cultivo celular de 0,8 OD a 750 nanómetros en un matraz de un litro y diluya en 500 mililitros de medio B-HEPES para lograr el OD de 0,2 a 750 nanómetros. Cultive el cultivo con agitación constante a 30 grados Celsius hasta que el OD alcance 0.8 a 1, lo que indica una fase de crecimiento exponencial tardío. Centrifugar el cultivo a una velocidad de 10, 000 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.

Suspenda los gránulos celulares y lávelos dos veces con tampón de fosfato de potasio molar 0,75, pH siete. Peletizar las células en un tubo centrífugo de 50 mililitros mediante centrifugación a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un tampón de fosfato de potasio molar de 0,75.

Mida el peso húmedo del pellet mediante una balanza electrónica y resuspenda el peso húmedo de un gramo del pellet en cinco mililitros del tampón. Agregue un mililitro de suspensión celular y de 0.4 a 0.6 gramos de perlas de vidrio de 0.1 milímetros en un vial de tapón de rosca de dos mililitros. Rompe las celdas durante 30 segundos con un batidor de cuentas.

Deje que los tubos se enfríen en un baño de agua a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la lisis, centrífuga los viales durante 10 segundos a temperatura ambiente a una velocidad de 500 veces g. Recoge el sobrenadante con una pipeta en un tubo centrífugo de 15 mililitros.

Lave las perlas con 0,5 mililitros de tampón de fosfato de potasio molar 0,75 una vez, luego transfiera al mismo tubo de centrífuga. Agregue Triton X-100 a la suspensión de células lisadas e incube en un agitador oscilante a temperatura ambiente y 40 RPM durante 20 minutos o hasta que la solución se vuelva homogénea. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 17, 210 veces g y almacenar el sobrenadante sin la capa superior de micela Tritón a temperatura ambiente durante un máximo de una hora.

Hacer cuatro concentraciones de sacarosa en tampón de fosfato de potasio molar 0.75 a pH siete. Coloque 2,8 mililitros de tampón de sacarosa molar en la parte inferior del tubo centrífugo de 40 mililitros y colóquelos con tres capas de soluciones de sacarosa. Finalmente, agregue tres mililitros de PBS que contengan la fracción sobrenadante y centrifugue los gradientes resultantes.

Tras la ultracentrificación, condensar el PBS fraccionado y las ficobiliproteínas entre las capas y observar las bandas azules en Syn6803 e interfaces. Retire la sacarosa concentrando y diluyendo repetidamente las fracciones con tampón de fosfato de potasio molar 0.75 y membran las unidades de filtro centrífugo. Para medir la fluorescencia de PBS, diluya la muestra concentrada de PBS con un tampón de fosfato de potasio molar de 0,75 para obtener un volumen de hasta 500 microlitros.

Agregue la muestra diluida de PBS a un tubo de vidrio transparente y congele el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado. Mueva el tubo congelado a un recipiente transparente de dewar prellenado con nitrógeno líquido. La lisis celular completa muestra el sobrenadante y el color azul verdoso oscuro antes de la centrificación.

La separación del gradiente de densidad de sacarosa de PBS aislados muestra varias fracciones de ficobiliproteínas disociadas y la fracción más baja representa el PBS intacto. Los espectros de absorción del PBS disociado e intacto de JSC one y Syn6803 tienen el mismo pico a 622 nanómetros, correspondiente a la ficocianina. Además, el pico de absorción de ficoeritrina a 571 nanómetros en PBS disociados e intactos de JSC-1.

Los espectros de emisión del PBS disociado tienen un pico fuerte de aproximadamente 650 nanómetros en Syn6803 y JSC-1, lo que representa la emisión de ficocianina. Los picos máximos de emisión fluorescente a 651 nanómetros y 684 nanómetros revelan que la energía recolectada por la ficocianina se transfirió de manera eficiente a la aloficocianina y a los emisores terminales, que son ApcD y ApcE, en el núcleo. La figura muestra SDS-PAGE teñido de zinc bajo irradiación UV donde las subunidades de ficobiliproteína son fuertemente fluorescentes y el ApcE mostró fluorescencia débil, indicada con la flecha.

La tinción azul de Kumasi muestra que las fracciones superiores contienen otras proteínas no solubles en agua pbS y el PBS intacto y Syn6803 muestran una banda apcE prominente, indicada con una flecha, que carece de las fracciones disociadas de PBS. La ultracentrifugación demuestra que el gradiente de sacarosa preparado en una proporción de 1:3 muestra bandas más anchas que el gradiente realizado en una proporción de 1:10. Es importante la lisis de las células y la solvolisis de los sobrenadantes por completo para obtener más ficobilisomas.

Otros métodos, como la crio-EM o la espectrometría mixta, se pueden utilizar para estudiar la estructura de las proteínas o la composición proteica de los ficobilisomas.