Visualización del desarrollo de cicatrices mediante el ensayo SCAD: un ensayo de cicatrización cutánea ex situ

Este protocolo describe la generación de un explante de piel-fascia denominado "tejido similar a SCar en un plato" o SCAD. Este modelo permite una visualización sin precedentes de fibroblastos individuales durante la formación de cicatrices.

Los modelos utilizados anteriormente in vitro o ex vivo carecen de componentes de células dérmicas y complejidad del tejido de la piel. Este ensayo SCAD ex situ supera una limitación establecida y permite estudiar el desarrollo de cicatrices fuera del animal herido. El ensayo SCAD permite la visualización de la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes de la piel.

Permite a las bibliotecas de detección de activadores o inhibidores comprender la base mecanicista de la formación de cicatrices. Ensayos de detección de alto rendimiento de bibliotecas planas utilizando el modelo SCAD para comprender el proceso fundamental y el curso de la molécula involucrado en la reparación de heridas. El ensayo SCAD es fácil de realizar utilizando los explantes de piel.

Para una cicatriz consistente, se recomienda seleccionar la piel postnatal del día cero o del primer día. Después de sacrificar el día cero postnatal o el cachorro recién nacido del primer día, use un bisturí quirúrgico estéril para extirpar cuidadosamente la piel dorsal dorsal de 1.5 por 1.5 centímetros de espesor completo hasta la capa muscular esquelética. Pelar la piel con pinzas curvas estériles, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente.

Lave el tejido extirpado con 50 a 100 mililitros de medio frío DMEM F-12 para eliminar la sangre contaminante. Luego, lave el tejido con la solución de sal equilibrada de Hanks para mantener la viabilidad del tejido y las células. Coloque la piel boca abajo con la fascia superficial en la parte superior en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga DMEM F-12 medio.

Luego, usando un punzón desechable de biopsia de dos milímetros, extirpe piezas de piel redondas de espesor completo para generar tejidos con costras, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente hasta la epidermis. Agregue 200 microlitros de medio completo DMEM F-12 fresco sin rojo fenol en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Usando fórceps estériles, transfiera y sumerja completamente el tejido de costras individual boca abajo a los pocillos de una placa de 96 pocillos.

Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular mantenida en condiciones estándar. En los días dos y cuatro de cultivo, retire el medio dejando 10 microlitros en el pozo y agregue un medio completo DMEM F-12 fresco precalentado junto con los compuestos de tratamiento para mantener las condiciones de viabilidad celular y tisular continuas. Para obtener imágenes en vivo de SCADs, prepare 30 mililitros de solución de agarosa de baja fusión al 2 a 3% en PBS en una botella de vidrio calentando en un microondas.

Después de hervir, transfiera inmediatamente la botella y enfríe la solución líquida de agarosa en un baño de agua de 40 grados centígrados. A continuación, transfiera el tejido SCAD con fascia o cicatriz hacia arriba en el centro de un plato de 35 milímetros. Luego incruste el SCAD a temperatura ambiente vertiendo lentamente agarosa líquida de 40 grados Celsius sobre el tejido usando una punta de pipeta de 1000 microlitros.

La agarosa polimeriza en dos minutos. Después de la polimerización, agregue dos mililitros de medio completo DMEM F-12 precalentado. Luego, utilizando un microscopio confocal o multifotónico equipado con sistemas de incubación adecuados explicados en el manuscrito, adquiera imágenes de lapso de tiempo del día cero al día uno.

Para la recolección de tejidos, lave los tejidos en los puntos de tiempo relevantes reemplazando el medio con PBS estéril. Usando pinzas estériles, transfiera cada SCAD a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de paraformaldehído al 2% para fijar los tejidos durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave los tejidos tres veces con PBS antes de proceder a la tinción de inmunofluorescencia bidimensional o tridimensional como se describe en el manuscrito de texto.

Las imágenes representativas de campo brillante de montaje completo de SCAD en los días cero y cinco se muestran aquí. La tinción tricrómica de Masson de secciones verticales de tejido revela firmas de cicatrización tisular, contracción tisular y acumulación de matriz extracelular en el núcleo de la cicatriz en los días cero y cinco. Se muestra la tinción de inmunofluorescencia de los SCADs en los días cero y cinco.

Desde la cicatriz temprana y tardía, el fibroblasto positivo arraigado se muestra en verde y el fibroblasto negativo arraigado en rojo. Para las imágenes tridimensionales, los tejidos se incrustaron en una solución de agarosa y se cubrieron con PBSGT. Las imágenes representativas demuestran la localización exclusiva de la proteína N-cadherina en el sitio de la cicatriz de un SCAD del día cinco.

La configuración de imágenes de lapso de tiempo tridimensional equipada con una cámara de incubación mostró eventos tempranos de progresión de los enjambres de fibroblastos durante las primeras 12 horas o las primeras etapas del desarrollo de la cicatriz. Aquí se presenta la representación gráfica de las trayectorias celulares rastreadas por una sola célula de fibroblastos individuales durante el desarrollo de cicatrices. Es crucial colocar el tejido SCAD boca abajo dentro de la placa del pozo para que la fascia mire hacia arriba.

De lo contrario, se producirían variaciones inevitables en los patrones de migración. Este procedimiento permite examinar las capas dérmicas para tratamientos o cultivos utilizando moduladores químicos, anticuerpos neutralizantes o métodos virales. Esto ayuda en la evaluación de las respuestas fibróticas patológicas en diversos entornos médicos.

Mostramos la expresión de conexina-43 y N-cadherina como moléculas clave involucradas en la movilización de la fascia al enrollarse. La metodología SCAD permite la identificación de nuevas estrategias terapéuticas para reducir la cicatrización y la fibrosis.