Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Un protocolo eficiente para mantener y amplificar el nematodo entomopatógeno es esencial para comprender las bases moleculares de la patogenicidad de los nematodos y la inmunidad anti-nematodos del huésped. Este protocolo nos permite producir un alto número de Heterorhabditis bacteriophora simbiótica y axénica y Steinernema carpocapsae IJs utilizando el huésped insecto, Galleria mellonella. Comience cubriendo la placa de Petri con un trozo de papel de filtro y agregue aproximadamente de 10 a 15 larvas de Galleria mellonella.

Usando una pipeta, dispense dos mililitros de agua que contengan alrededor de 25 a 50 juveniles infecciosos por cada 10 microlitros de suspensión sobre los gusanos de cera. Y guarde la placa de Petri en un gabinete a temperatura ambiente. Dependiendo de la humedad del papel de filtro, agregue de uno a dos mililitros de agua cada dos días.

Los gusanos de cera infectados con juveniles infecciosos generalmente mueren dentro de las 48 horas. Prepare las trampas de agua de White aproximadamente 10 días después de que los gusanos de cera estén infectados con los juveniles infecciosos. Transfiera cuidadosamente los insectos muertos a la parte no empapada del papel de filtro.

Use agua del grifo para llenar la placa de Petri inferior y coloque una tapa de un tubo de 15 mililitros como espaciador para la ventilación. Use agua del grifo en lugar de agua desmineralizada o desionizada para evitar la agregación de nematodos, y asegúrese de que el nivel de agua en la trampa de agua alcance aproximadamente la mitad de la altura de la placa de Petri. Cuando el agua en la pequeña placa de Petri se vuelve turbia debido a los nematodos, use una pipeta para mover la nueva generación de juveniles infecciosos a un matraz de cultivo de células T25 o T75.

Más tarde, agregue agua del grifo hasta un 40% de volumen o hasta que se alcance la densidad adecuada. Y almacene el matraz de cultivo celular horizontalmente para evitar la congestión de nematodos. Repetir la transferencia de juveniles infecciosos a matraces de cultivo celular y la adición de agua hasta que los juveniles infecciosos dejen de emerger de los cadáveres de insectos en aproximadamente tres a cinco días.

Usando un bucle de inoculación, raspe varias escamas de un cultivo congelado de Photorhabdus temperata Ret16 en una placa MacConkey y una raya para colonias individuales. Incubar la placa durante dos o tres días a 28 grados centígrados. Después de la incubación, inocule 10 mililitros de caldo LB con una colonia en agar MacConkey en un tubo de 50 mililitros e incube el cultivo durante la noche a 28 grados Centígrados en una incubadora de agitación.

Después de la incubación, transfiera 100 microlitros de cultivo nocturno de un tubo de 50 mililitros a un nuevo tubo de microcentrífuga, luego lave 100 el cultivo nocturno con 900 microlitros de PBS de una sola fuerza por centrifusión, en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros, a 17, 900 veces g. Decantar el sobrenadante. A continuación, diluya el cultivo 10 veces en PBS de una sola fuerza y deje el tubo en hielo.

Ahora, sumerja los gusanos de cera en una solución de etanol al 70%. Después de secar los insectos con una toalla de papel, colóquelos en un tubo de 50 mililitros. Coloque el tubo sobre hielo durante 20 minutos para inmovilizar los gusanos de cera.

Use papel de filtro para cubrir las mitades superior e inferior de una placa de Petri. Utilice la tapa de la placa de Petri cubierta con papel de filtro como soporte base para la inyección. Humedezca en el papel de filtro de la placa de Petri inferior y transfiéralo sobre hielo para ayudar a los gusanos de cera inyectados a recuperarse.

Pipetee 50 microlitros de bacterias heladas en un trozo de Parafilm, luego prepare una jeringa de aguja refinadora de calibre 22 y presione el émbolo suavemente para eliminar el aire en la punta de la aguja. Mantener un gusano de cera cerca del extremo posterior debajo del estereoscopio. Inyecte cultivo bacteriano en el lado dorsal del tórax.

Preferiblemente en la unión entre dos segmentos justo debajo de la cutícula paralela al gusano de cera para minimizar el daño interno y prestar atención a cómo el cuerpo larvario comienza a abultarse. A continuación, transfiera los insectos inyectados a la placa de Petri de recuperación. Y una vez que todos los insectos se inyectan y se colocan en el plato de recuperación, coloque la placa de Petri en la oscuridad.

Los gusanos de cera sucumben dos días después de la inyección y aparecen de color rojo ladrillo después de aproximadamente tres o cuatro días. Sin embargo, los insectos de color marrón indican una infección bacteriana fallida. A los siete días después de la infección, transfiera los insectos con el característico color rojo ladrillo a una placa de Petri forrada de papel de filtro fresco y repita la producción de juveniles infecciosos de nematodos simbióticos.

Para comenzar la esterilización superficial, recolectar suficientes juveniles simbióticos, Heterorhabditis bacteriophora y candidatos infecciosos axénicos por centrifugación. Para hacer un pellet en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, agregue 500 microlitros de lejía al 5% al pellet en cada tubo de microcentrífuga e invierta el tubo. Después de incubar durante 10 minutos, centrífuga a 17, 900 veces g durante un minuto y retire el sobrenadante.

Luego lave el pellet con un mililitro de agua estéril. Centrifugarlo, retirar el sobrenadante y repetir este procedimiento cuatro veces más. El gráfico muestra los resultados de la evaluación del estado de los nematodos Heterorhabditis bacteriophora que han pasado por axenización.

Heterorhabditis bacteriophora del cultivo de stock transportó células simbióticas de Photorhabdus luminescens. Sin embargo, los nematodos desprovistos de su bacteria Photorhabdus luminescens asociada eran axénicos. Para mantener la reproducibilidad de su experimento, siempre raye recién salido del cultivo de cepas bacterianas de una colonia fresca y saque el cultivo nocturno antes de que llegue a la cara estacionaria.

Solo use el gusano de cera Galleria rojo ladrillo para la trampa de agua de White y deseche el resto. Después de este procedimiento, los nematodos se pueden usar para investigar la interacción con el sistema inmunológico de los insectos. Esta técnica allana el camino para que el investigador explore las bases moleculares del parasitismo de nematodos y la inmunidad anti-nematodos del huésped.