Cribado genético para la identificación de supresores multicopia en Schizosaccharomyces pombe

Las pantallas supresoras identifican interacciones genéticas que arrojarían luz sobre las funciones del gen de interés, así como las vías y procesos biológicos en los que pueden estar involucrados in vivo. Esta técnica puede identificar una relación genética entre dos productos génicos que puede no haber sido demostrada utilizando otros enfoques. Los resultados de tales pantallas en la levadura pueden extenderse a organismos eucariotas altos, ya que la mayoría de las vías y procesos biológicos fundamentales se conservan a lo largo de la evolución.

El éxito del esquema depende de la disponibilidad, de alta calidad y la alta eficiencia de su transformación en células de levadura. Por lo tanto, el protocolo de transformación con el plásmido antes de Grow the Schizosaccharomyces pombe ell1 deleción de la cepa a 32 grados centígrados en la placa media YE. Tome un bucle lleno de la cepa mutante ell1 de la placa, inocule cinco mililitros de medio YE suplementado y luego incube el vial mientras agita a 32 grados centígrados durante la noche.

Después de la incubación, diluir el cultivo de crecimiento durante la noche en 100 mililitros de medio YE fresco que contenga los suplementos deseados para alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 600 nanómetros. Incubar el medio a 32 grados centígrados mientras agita a 200 a 550 RPM hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance la fase logarítmica media. Después de dividir los 100 mililitros de cultivo en dos tubos de centrífuga de 50 mililitros, granular las células a 4, 000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Una vez desechado el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de agua estéril. Centrifugar y desechar el sobrenadante una vez más y luego resuspender el pellet celular en un mililitro de acetato de litio TE. Granular la célula por centrifugación y resuspender cada célula de pellet en 250 microlitros de acetato de litio TE. A continuación, transfiera 125 microlitros de las células competentes a cuatro tubos de microcentrífuga estériles diferentes para los pasos de transformación posteriores. Hervir el ADN portador de los testículos de salmón o el esperma de arenque durante un minuto e inmediatamente colocar el tubo en hielo.

Para cada transformación, agregue 10 microlitros de ADN portador monocatenario al tubo de microcentrífuga que contiene 125 microlitros de las células competentes y mezcle suavemente con el pipeteo. Posteriormente, agregue 50 microgramos de la biblioteca de ADNc de Schizosaccharomyces pombe al tubo que contiene células competentes y mezcla de ADN portador. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos, agregue 260 microlitros de solución de acetato de polietilenglicol-litio y mezcle con pipeteo.

Incubar el tubo que contiene la mezcla de transformación a 32 grados centígrados durante dos horas sin agitar. Agregue 43 microlitros de dimetilsulfóxido precalentado al tubo y mezcle suavemente. Ahora, exponga el tubo a un choque térmico a 42 grados centígrados durante cinco minutos.

Granular las células y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente y luego pipetear la solución residual de acetato de litio de polietilenglicol TE . Resuspender las células en 100 microlitros de agua estéril y colocarlas en una placa EMM2 que contenga los suplementos requeridos y 0,2 microgramos por mililitro de 4-NQO. Luego, permita que las colonias aparezcan en las placas incubando las placas a 32 grados centígrados durante cinco a seis días.

Para una mayor detección, raye las colonias obtenidas en la misma placa mediana en presencia de 0,2 microgramos por mililitro de 4-NQO. Para un experimento de transformación de biblioteca, use 500 microlitros de células competentes para la transformación y coloque 1 por 10 de la mezcla de transformación en la placa EMM2 con los suplementos requeridos que carecen de 4-NQO para calcular el número total de clones de biblioteca obtenidos después de la transformación y detectar los clones supresores. Agregue de 100 a 200 microlitros de agua estéril a cada pocillo de una placa estéril de microtitulación de 96 pocillos.

Usando un palillo estéril o una punta de micropipeta de 20 a 200 microlitros, elija una pequeña cantidad de inóculo de cada colonia obtenida después de la transformación de la biblioteca de ADNc en la placa que contiene 4-NQO. Agregue el inóculo de cada una de las diferentes colonias en cada pocillo de la placa que contiene agua estéril y mezcle bien. Coloque tres microlitros de la suspensión celular de cada pocillo en placas de agar EMM2 y agregue concentraciones apropiadas de 4-NQO a las placas.

Después de cultivar las células a 32 grados centígrados durante tres o cuatro días, identifique las colonias que muestran crecimiento en diferentes concentraciones de 4-NQO como supresores putativos. Para validar aún más los supresores, cultive los supresores seleccionados y las cepas de control apropiadas en medio EMM2 que contiene 225 microgramos por mililitro de adenina y uracilo a 32 grados centígrados durante la noche con agitación. Después del final de la incubación, diluir las células a una densidad óptica de 0,3 en medio EMM2 fresco y cultivarlas mientras agitan a 32 grados centígrados hasta la fase media logarítmica.

Detectar diluciones seriadas apropiadas de cultivos en placas EMM2 con suplementos requeridos que contengan 0.4 micromolar 4-NQO o 0.01% MMS. Para el control, detecte las cepas en una placa EMM2 con los suplementos requeridos pero que carecen de cualquier agente dañino para el ADN. Incubar las placas a 32 grados centígrados durante tres a cinco días para controlar el crecimiento.

Detecte las cepas mutantes transformadas con el gen de interés de longitud completa o el vector vacío como controles positivos y negativos, respectivamente, junto con los transformadores de biblioteca. Inocular una sola colonia de levadura en medio EMM2 que contenga 225 microgramos por mililitro de adenina y uracilo y hacer crecer las células a 32 grados centígrados durante la noche con agitación a 200 a 250 RPM. Al final de la incubación, cosecha 10 mililitros de cultivo de densidad óptica 0.5 centrifugando a 4, 000 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 0,2 mililitros de tampón de lisis. Agregue 0,2 mililitros de alcohol isoamílico cloroformo de fenol y 0,3 gramos de perlas de vidrio lavadas con ácido al tubo de microcentrífuga. Mezclar haciendo vórtice del tubo durante dos minutos, seguido de incubar en hielo durante un minuto.

Centrifugar el tubo a 10, 000 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga fresco y agregue 200 microlitros de alcohol isoamílico de cloroformo fenol. Después de centrifugar nuevamente a 10, 000 veces G durante 10 minutos, transfiera la capa acuosa superior a un tubo nuevo.

Luego, agregue dos volúmenes de 100% de etanol y 1 por 10 volumen de acetato de sodio al tubo e incube a menos 70 grados centígrados durante una hora. Precipitar el ADN por centrifugación a 10, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y eliminar el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con etanol al 70% y seque al aire a temperatura ambiente.

Resuspender el ADN en 20 microlitros de agua estéril y utilizar de tres a cinco microlitros de ADN plásmido para transformar las células competentes de Escherichia coli. Usando el protocolo estándar, transformar los plásmidos de levadura aislados en la cepa TOP10 de Escherichia coli y esparcir las células en placas LB con los antibióticos requeridos. Después de aislar el plásmido de los transformadores de Escherichia coli utilizando el protocolo estándar de lisis alcalina, siga las combinaciones apropiadas de enzimas de restricción para verificar la liberación del fragmento de ADN insertado por digestión de restricción.

A continuación, retransforme los plásmidos que muestran liberación de inserción después de la digestión de restricción en la cepa de deleción ell1 para verificar su capacidad para rescatar el fenotipo genotóxico sensible al estrés de la cepa de deleción ell1. La cepa Schizosaccharomyces pombe eliminada por ell1 mostró sensibilidad hacia 4-NQO en comparación con la cepa de tipo salvaje. Se obtiene un gran número de colonias en la placa que carece de 4-NQO.

Sin embargo, se obtuvieron menos transformadores en la placa 4-NQO, ya que actúan como supresores punitivos de la sensibilidad 4-NQO del mutante nulo ell1. De los 620 transformadores, 74 mostraron crecimiento en 0,4-micromolar 4-NQO. Se observó que sólo 16 de 74 mostraron crecimiento en presencia de 0,8-micromolar 4-NQO.

La decepción de deleción ell1 se transformó con un vector vacío y los 16 transformadores mostraron crecimiento en la placa que carecía de 4-NQO. El mutante de deleción ell1 que contenía solo el vector vacío no mostró crecimiento a 0.8-micromolar 4-NQO y seis transformadores exhibieron crecimiento a 0.8-micromolar 4-NQO, lo que sugiere que los clones de biblioteca presentes en ellos podrían suprimir el fenotipo de estrés genotóxico del mutante nulo ell1. La digestión restrictiva del plásmido supresor 84 y 104 liberó un inserto de un kilobase y 800 pares de bases, respectivamente.

La reintroducción de los clones de plásmidos supresores en el mutante nulo ell1 resultó en la supresión de la sensibilidad de crecimiento asociada a 4-NQO. Sin embargo, en presencia de MMS, los plásmidos supresores que contenían el mutante de deleción ell1 mostraron más crecimiento que aquellos con vector vacío. Estas pruebas genéticas pueden delinear posibles mecanismos de resistencia e identificar objetivos proteicos de nuevos compuestos antibacterianos, antifúngicos, antiparasitarios o anticancerígenos.

También pueden identificar el mecanismo de acción de los fármacos farmacéuticos.