Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Este protocolo permite identificar y cuantificar el virus del Zika sin depender del efecto citopático. Depende del reconocimiento de anticuerpos del componente del virus. El uso de anticuerpos específicos del virus puede ayudar a identificar diferentes serotipos de virus en poblaciones mixtas.

Este método tiene ventajas sobre los ensayos clásicos de formación de placas. Es más rápido y está habilitado para aplicaciones de alto rendimiento cuando se aplica con un sistema de imágenes automatizado para un recuento rápido de células. El protocolo propuesto es altamente adaptable.

Con las modificaciones adecuadas, el protocolo propuesto se puede aplicar a varios tipos de células y dianas virales. Comience cultivando células Vero en un matraz de cultivo celular de 75 cuadrados = centímetros que contiene 12 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y dos milimoles de L-glutamina. Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Para infectar la monocapa celular, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar el medio de crecimiento del matraz de cultivo celular. Con una pipeta serológica de cinco mililitros, enjuague el matraz con tres mililitros de DPBS dos veces. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM sin suero y 20 microlitros de inóculo del virus del Zika en el matraz de cultivo celular.

Deje que el matraz se incube a temperatura ambiente durante una hora con un balanceo suave para estimular la adsorción de virus. Al final de la incubación, utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, retire y deseche cuidadosamente el inóculo del virus diluido del matraz de cultivo celular. Enjuague el matraz de cultivo celular dos veces con tres mililitros de DPBS.

A continuación, se añaden 12 mililitros de medios de mantenimiento en el matraz de cultivo celular para mantener las células infectadas. Incubar las células Vero infectadas durante tres días en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de tres días de incubación, use una pipeta serológica de 10 mililitros para recolectar el sobrenadante de cultivo celular que contiene el virus del Zika en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Para la cuantificación del virus, siembre las células Vero en placas designadas y déjelas crecer durante la noche a 37 grados centígrados con una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Prepare seis tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros para cada placa para realizar una dilución en serie diez veces, incluido un tubo adicional para un control negativo. Para una configuración de placa de 24 pocillos, agregue 450 microlitros de DMEM sin suero a los seis tubos de microcentrífuga.

Para una configuración de placa de 96 pocillos, dispense 135 microlitros de DMEM sin suero a seis tubos adicionales. Para realizar la dilución en serie para el experimento de la placa de 24 pocillos, agregue 50 microlitros de la reserva del virus del Zika en el tubo de 10 a menos uno que contiene 450 microlitros de DMEM sin suero. Para el experimento de la placa de 96 pocillos, agregue 15 microlitros de caldo del virus del Zika en el tubo de 10 a menos un tubo que contenga 135 microlitros de DMEM sin suero.

Agite cada tubo para mezclar bien el virus y el medio, asegurando una distribución uniforme de las partículas de virus dentro de la dilución. Con una punta de pipeta nueva, vuelva a suspender el tubo de 10 a menos uno y transfiera 50 y 15 microlitros del virus del Zika diluido al tubo de 10 a menos dos como una segunda dilución de diez veces para las placas de 24 y 96 pocillos, respectivamente. Retire y deseche el medio de condición para cada pocillo de la placa apropiada.

Enjuague cada pocillo con DPBS dos veces para eliminar cualquier residuo. Comenzando con la dilución más alta, agregue el inóculo del virus diluido en serie en los pocillos, trabajando hacia la dilución más baja. Después de una hora de incubación, retire y deseche la suspensión del virus de los pocillos, comenzando con la concentración más baja a la más alta.

Lave las células infectadas con DPBS dos veces para eliminar cualquier rastro de suspensión del virus. Recubra el pocillo con DMEM y carboximetilcelulosa de baja viscosidad al 1,5%. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Después de la incubación, retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas tres veces con PBS. Para la placa de 96 pocillos, utilice una pipeta multicanal para retirar y desechar el medio de recubrimiento, y lave las células tres veces con 60 microlitros de PBS por pocillo. Agregue un 4% de paraformaldehído para fijar las células e incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, deseche el paraformaldehído y lave las células tres veces con PBS. A continuación, agregue el sustrato de 3,3'diaminobencidina peroxidasa e incube la placa durante 30 minutos en la oscuridad. Después de 30 minutos, detenga la reacción lavando los pozos con agua.

Seque las placas al aire durante la noche y proceda a la enumeración de focos. Cuente los focos para cada réplica de la dilución seleccionada y calcule el número promedio de focos para cada uno. Las células Vero infectadas se fijaron en diferentes momentos después de la infección.

Para la placa de 2 pocillos, la primera aparición de focos de virus se observó 48 horas después de la infección, aunque el tamaño de los focos era demasiado pequeño para contarlo con precisión. Después de 96 horas después de la infección, no había signos de desprendimiento celular. A las 60 horas después de la infección, el tamaño de los focos había aumentado a un nivel óptimo para el recuento.

Posteriormente, a medida que avanzaba el tiempo, los focos se hicieron más grandes y comenzaron a fusionarse o superponerse entre sí en intensidad, formando grupos que crecieron con el tiempo. Por lo tanto, se eligieron focos formados 60 horas después de la infección para determinar el título del virus del Zika en una placa de 24 pocillos. Para la placa de 96 pocillos, las células permanecieron intactas después de 72 horas después de la infección.

La aparición de focos virales se observó por primera vez 24 horas después de la infección. Sin embargo, hasta 36 horas después de la infección, el tamaño de los focos era demasiado pequeño. El tamaño óptimo de los focos se alcanzó a las 48 horas después de la infección.

En estos últimos momentos, se observaron focos superpuestos o fusionados, y el número de focos superpuestos aumentó con el tiempo. Los focos se formaron 48 horas después de que se eligió la infección para determinar el título del virus de las cepas aisladas del virus del Zika. Agregue suavemente DPBS por el costado de cada pocillo y mueva las placas hacia atrás y hacia adelante de una a tres veces para eliminar los desechos celulares y el exceso de medios.

Esta técnica beneficiará en gran medida a los investigadores en la investigación del zika, y también se puede adaptar ampliamente para cuantificar otros virus clínicamente importantes, lo que la convierte en una herramienta valiosa para la vigilancia y el diagnóstico del virus.