Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

El objetivo general de este procedimiento es identificar las etapas en las que la expresión génica viral se ve afectada por el tratamiento químico. Para ello, se siembran células de cultivo de tejidos y se incuban hasta alcanzar confluencia. Luego, las células se infectan con un virus de la vaccinia que expresa un triple marcador reportero o con un virus control careciente de promotor.

A continuación, se aplican los compuestos de tratamiento y las células se incuban durante 18 horas para permitir la finalización de todas las etapas de la expresión génica viral. Luego, se determina la fluorescencia resultante utilizando un lector de placas. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran los cambios relativos en la expresión provocados por los compuestos experimentales.

La principal ventaja de esta técnica frente a la infección con un virus que expresa una única proteína de fusión fluorescente es que este conjunto de virus proporciona más información sobre en qué etapa del ciclo vital viral actúa un fármaco terapéutico específico, ofreciendo una visión sobre su mecanismo de acción. Aunque este método puede utilizarse para identificar inhibidores de la infección viral, también puede emplearse para detectar la etapa de replicación viral completada en líneas celulares no permisivas o en ensayos con ARNi, identificando así factores celulares necesarios para la infección. Este protocolo utiliza el virus marcador multietapa denominado virus triple o TrpV, en el cual tres fluoróforos espectralmente distintos se incorporan al genoma bicatenario de un único virus vaccinia.

Cada uno de estos fluoróforos está controlado por un promotor específico bien definido para cada etapa. El promotor C 11 R para la expresión temprana de Venus, el promotor intermedio G eight R para la expresión de m-cherry y el promotor F 17 R para la expresión en etapa tardía de tag BFP. Por lo tanto, Venus, m-Cherry y tag BFP se expresan secuencialmente durante la infección.

Como control, se utiliza un virus sin promotor. PLV contiene un constructo Venus similar al del TrpV, sin embargo, no posee un promotor de transcripción funcional.

Comience este protocolo disociando células HeLa cultivadas en una placa de 10 centímetros de diámetro. Diluya las células en medio de crecimiento hasta aproximadamente 2,0 × 10⁵ células por mililitro. A continuación, distribuya 100 µL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo transparente, paredes negras y fondo plano. Incube las células durante 24 horas en un incubador a 37 °C con 5 % de dióxido de carbono hasta que alcancen confluencia. Para diluir los virus, descongele TrpV y PLV en un baño de agua a 37 °C, luego sométalos a sonicación durante cinco minutos para desagregarlos. A continuación, diluya el stock de virus hasta 1,0 × 10⁷ PFU por mililitro en medio de infección previamente calentado a 37 °C.

Para infectar las células, sustituya el medio de crecimiento por 50 microlitros del virus diluido en cada pocillo. Para cada tratamiento, infecte tres pocillos por triplicado con TrpV y otros tres con PLV para tener en cuenta la fluorescencia de fondo específica de cada tratamiento. Esto se define como el tiempo igual a cero horas postinfección. Por ejemplo, prepare 350 microlitros para 6 pocillos de una placa de 96 pocillos, con 50 microlitros cada uno. Cada compuesto debe diluirse a una concentración doble de la final, ya que se añadirá al volumen de inóculo ya presente en el pocillo. A continuación, para cada condición de tratamiento, prepare una mezcla maestra 2x diluyendo los compuestos experimentales o los disolventes de control vehículo, como PBS o DMSO, en la cantidad suficiente de medio de infección para todos los replicados, más uno adicional. Tenga en cuenta que la concentración de disolvente en los controles experimentales y en los controles con vector únicamente debe ser la misma. Por ejemplo, si está utilizando IBT a una concentración de un microlitro por mililitro en DMSO, también debe usar DMSO solo a una concentración de un microlitro por mL como control de vector. Inmediatamente después de añadir el virus, agregue 50 microlitros de medio de infección que contenga los compuestos de tratamiento y control deseados a cada pocillo, como se muestra en esta ilustración.

Téngase en cuenta que cada compuesto se prueba con TrpV y PLV por triplicado, y se incluye un control de vehículo por triplicado para cada virus.

Incubar durante 18 horas en un incubador a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, fijar las células añadiendo 100 µL de paraformaldehído al 8 % al medio de infección ya presente en cada pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos protegida de la luz.

Agregar dos x o 8 % de paraformaldehído directamente al medio de infección evitará la aerosolización del virus, lo cual podría ocurrir si el virus no fijado se invierte directamente en el recipiente de desecho. Después de 15 minutos, retire el fijador invirtiendo la placa en el recipiente de desecho. Luego, agregue 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente y selle la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.

Si la placa no se va a leer inmediatamente, almacénela a cuatro grados Celsius. Asegúrese de devolver las placas selladas a temperatura ambiente antes de leerlas para evitar que la condensación distorsione las mediciones del espectrofotómetro.

Para cuantificar el crecimiento viral, utilice un espectrofotómetro para medir la fluorescencia en el punto final. Realice cuatro mediciones por pocillo utilizando ajustes de ganancia optimizados para cada canal. El lector de placas TECAN Infinite M 1000 Pro utilizado en este video exporta las mediciones de fluorescencia crudas a un archivo de Microsoft Excel. Después de obtener las lecturas, abra los datos crudos en Microsoft Excel.

Luego, copie y pegue los datos en una hoja de resultados de GraphPad Prism. En Prism, determine la media de los pocillos TrpV y PLV replicados. A continuación, reste el valor medio de PLV al valor medio de TrpV para cada tratamiento. Para facilitar la comparación con experimentos replicados, normalice los datos dividiendo los datos corregidos por fondo entre los pocillos TrpV con vehículo únicamente. Una vez que se haya repetido el experimento varias veces, realice un análisis de varianza unidireccional o prueba ANOVA unidireccional y una prueba post-hoc de comparaciones múltiples para determinar si alguno de los tratamientos es significativamente diferente al tratamiento con DMSO para cada canal. Para realizar ensayos cinéticos, infecte las células y aplique los compuestos de prueba como antes; es particularmente importante utilizar un medio tamponado para mantener el pH adecuado sin la adición de 5 % de dióxido de carbono.

Después de sellar la placa con una película adhesiva, colóquela en la cámara del lector de placas equilibrada a 37 grados Celsius. Es fundamental tener especial cuidado en mantener las placas constantemente a 37 grados Celsius. Esto evitará el estrés celular innecesario y la condensación.

Configure manualmente la ganancia del lector de placas para evitar la saturación de los puntos temporales posteriores. Adquiera lecturas horarias durante ocho a 24 horas posteriores a la infección y normalice como en el ensayo de punto final. Los puntos temporales individuales pueden analizarse para determinar significancia estadística utilizando métodos similares a los descritos previamente para el ensayo de punto final.

Para comparar los puntos de inhibición, se cultivaron células HeLa infectadas con vaccinia TrpV o PLV en presencia de los inhibidores de virus de la viruela AraC, IBT, rifampicina y ST 246. Esta película de lapsos de tiempo muestra la expresión secuencial de fluorocromos verdes, rojos y azules durante el crecimiento viral en células de control. Cuando la infección ocurre en presencia del fármaco que bloquea la replicación del ADN, AraC, el fluorocromo verde temprano se produce como antes, pero no ocurre la producción intermedia y tardía de fluorescencia roja y azul.

El análisis cuantitativo mediante espectrometría mostró un aumento del 210 % en la expresión temprana de genes, pero una falta de expresión intermedia y tardía en células tratadas con araC. Las células infectadas en presencia de IBT, que se cree que promueve la transcripción por lectura continua, presentaron niveles de expresión intermedia y tardía equivalentes al 24,7 % y al 2,9 % de los niveles del control. Las células infectadas en presencia de ST246 y rifampicina, que inhiben la expresión posterior a los genes tardíos durante el ensamblaje y maduración del virión, no mostraron diferencias significativas respecto a los controles. Estos resultados son coherentes con el mecanismo de acción conocido de estos compuestos y sugieren que el virus reportero TrpV puede utilizarse para identificar la etapa específica de inhibición viral de compuestos desconocidos.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar incluir los controles adecuados. Esto no solo permite la normalización adecuada de los resultados, sino también determinar un mecanismo potencial para su compuesto experimental. No olvide que trabajar con el virus de la vaccinia puede ser extremadamente peligroso; siempre use el equipo de protección personal adecuado y siga las técnicas recomendadas de contención de nivel BSL-2.