Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.

El objetivo general de este procedimiento es identificar las etapas en las que la expresión génica viral se ve afectada por el tratamiento químico. Para ello, se siembran e incuban células de cultivo de tejidos. Hasta que confluyen, las células se infectan con un virus vaccinia triple reportero o con un virus de la lista de promotores de control.

A continuación, se aplican compuestos de tratamiento y las células se incuban durante 18 horas para permitir la finalización de todas las etapas de la expresión génica viral. A continuación, se determina la fluorescencia resultante mediante un lector de placas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los cambios relativos en la expresión causados por los compuestos experimentales.

La principal ventaja de esta técnica sobre la infección con un virus que expresa una sola proteína de fusión fluorescente es que este conjunto de virus proporciona más información sobre en qué parte del ciclo de vida viral está actuando un fármaco terapéutico específico, proporcionando información sobre su mecanismo de acción. Aunque este método se puede utilizar para identificar inhibidores de la infección viral, también se puede utilizar para detectar la etapa de replicación viral completada en líneas celulares no permisivas o en cribados de ARNi, identificando los factores celulares necesarios para la infección. Este protocolo utiliza el virus triple o el virus reportero de múltiples etapas Trip V, en el que se incorporan tres fluoro cuatro espectralmente distintos en el genoma de doble cadena de un solo virus venia.

Cada uno de estos cuatro fluorados está controlado por un promotor específico de etapa bien definido. El promotor C 11 R para la expresión temprana de Venus, el promotor intermedio G 8 R para la expresión de m cherry y el promotor F 17 R para la expresión en etapa tardía de la etiqueta BFP. Por lo tanto, Venus m Cherry y tag BFP se expresan secuencialmente durante la infección.

Como control, se utiliza un virus de la lista de promotores. El PLV contiene una construcción venosa similar a la del Trip V. Sin embargo, no tiene un promotor de transcripción funcional. Comience este protocolo disociando.

Las células Hela cultivadas en un plato de 10 centímetros, diluyen las células en el medio de crecimiento a aproximadamente 2,0 veces 10 a la quinta célula por mililitro. A continuación, dispense 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano transparente de paredes negras, incube las células durante 24 horas en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono hasta que confluyan para diluir los virus, descongele Tripp V y PLV en un baño de agua a 37 grados centígrados, y luego sonique durante cinco minutos para que se desagüen. A continuación, diluya el stock de virus a 1,0 veces 10 por la séptima UFP por mililitro en un medio de infección que haya sido precalentado a 37 grados centígrados para infectar las células.

Reemplace el medio de crecimiento con 50 microlitros del virus diluido en cada pocillo para cada tratamiento. Infecte tres pocillos replicados con Tripp V y otros tres con PLV para tener en cuenta la fluorescencia de fondo específica de cada tratamiento. Esto se define como el tiempo es igual a cero horas.

Después de la infección, por ejemplo, haga 350 microlitros para 6 96 pocillos con 50 microlitros cada uno. Cada compuesto debe diluirse al doble de la concentración final, ya que se agregará al volumen de inóculo que ya está en el pozo. A continuación, para cada condición de tratamiento, haga una mezcla maestra de dos veces diluyendo los compuestos experimentales o los solventes de control de vehículos, como PBS o DMSO, en una cantidad suficiente del medio de infección para todas las réplicas.

Más uno, tenga en cuenta que la concentración de solvente en sus controles experimentales y vectoriales debe ser la misma. Por ejemplo, si está usando IBT a un microlitro por mil en DMSO, también debe usar DMSL solo a un microlitro por mil como control vectorial. Inmediatamente después de agregar el virus, agregue 50 microlitros de medio de infección que contenga los compuestos de tratamiento y control deseados a cada pocillo, como se muestra en esta ilustración.

Tenga en cuenta que cada compuesto se prueba con Tripp V y PLV por triplicado, y se ejecuta un control de vehículo por triplicado para cada virus. Incubar durante 18 horas en una incubadora a 37 grados centígrados más un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, fije las células agregando 100 microlitros de aldehído paraformado al 8% al medio de infección ya en cada pocillo, incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos protegida de la luz.

La adición de dos aldehídos x o 8% de paraforme directamente al medio de infección evitará la aerosolización del virus, que de otro modo podría ocurrir si el virus no fijado se invierte directamente en el plato de desechos. Una vez transcurridos 15 minutos, retire el fijador invirtiendo la placa en el depósito de residuos. A continuación, añada 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente y selle la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.

Si la placa no se va a leer inmediatamente, guárdela a cuatro grados centígrados. Asegúrese de devolver las placas selladas a temperatura ambiente antes de leerlas para evitar que la condensación distorsione las mediciones del espectrofotómetro. Para cuantificar el crecimiento del virus, utilice un espectrofotómetro para medir la fluorescencia del punto final.

Realice cuatro mediciones por pocillo utilizando configuraciones de ganancia optimizadas para cada canal. El lector de placas TAN Infinite M 1000 Pro utilizado en este vídeo exporta las mediciones de fluorescencia en bruto a un archivo de Microsoft Excel. Una vez que se hayan obtenido las lecturas, abra los datos sin procesar en Microsoft Excel.

A continuación, cópialo y pégalo en un prisma GraphPad. La hoja de resultados en Prisma determina la media de los pozos Tripp v y PLV replicados. A continuación, reste el valor medio de PLV del valor medio de Tripp V para cada tratamiento.

Para facilitar la comparación con los experimentos replicados, normalice los datos dividiendo los datos de fondo sustraídos por el vehículo Tripp v Wells. Una vez que un experimento se haya repetido varias veces, realice un análisis de varianza unidireccional o unidireccional una prueba NOVA y una comparación múltiple posterior para determinar si alguno de los tratamientos es significativamente diferente del tratamiento DMSO. Para que cada canal realice ensayos cinéticos, infecte las células y aplique compuestos de prueba como antes, es particularmente importante usar un medio tamponado para mantener el pH adecuado sin agregar un 5% de dióxido de carbono.

Después de sellar la placa con una película adhesiva, colóquela en la cámara del lector de placas en equilibrio a 37 grados centígrados. Se debe tener especial cuidado para mantener las placas constantemente a 37 grados centígrados. Esto evitará la tensión celular excesiva y la condensación.

Configure manualmente la ganancia del lector de placas para evitar la saturación de puntos de tiempo posteriores. Adquirir lecturas por hora durante ocho a 24 horas después de la infección y normalizar. En cuanto al ensayo de punto final, los puntos de tiempo individuales se pueden analizar para determinar la significación estadística utilizando métodos similares al ensayo de punto final descrito anteriormente.

Para comparar los puntos de inhibición, se cultivaron células del talón infectadas con TPV o PLV vaccinia en presencia de los inhibidores del virus de la viruela, Aris, CIBT, rifampicina y ST 2 46. Esta vez, la película de lapso muestra la expresión secuencial de fluoro cuatro verdes, rojos y azules durante el crecimiento del virus en las células de control cuando se infectan en presencia del fármaco que bloquea la replicación del ADN aee. El fluorescencia verde 4 temprano se produce como antes, pero no se produce la producción intermedia y tardía de fluorescencia roja y azul.

El análisis cuantitativo por espectrometría mostró un aumento del 210% en la expresión génica temprana, pero una falta de expresión intermedia y tardía en las células tratadas con células C infectadas en presencia de IBT, que se cree que promueve. La transcripción leída tuvo niveles de expresión intermedios y tardíos que fueron el 24,7% y el 2,9% de los niveles de control, las células infectadas en presencia de ST 2 46 y rifampicina, que inhiben después de la expresión génica tardía durante el ensamblaje y maduración del virión, no fueron significativamente diferentes de los controles. Estos resultados son consistentes con el mecanismo de acción de estos compuestos y sugieren que el virus reportero Trip V se puede usar para identificar la etapa específica de inhibición viral para compuestos desconocidos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe incluir los controles adecuados. Esto no solo permite la normalización adecuada de los resultados, sino también determinar un mecanismo potencial para su compuesto experimental. No olvide que trabajar con el virus vaccinia puede ser extremadamente peligroso, use siempre el equipo de protección personal adecuado y siga el bsl recomendado.

Dos técnicas de contención.