Name: Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprende un método de homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética para producir vesículas derivadas de endosomas a gran escala. Esta técnica mejora el rendimiento y reduce costos en investigación biomédica.

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Los autores reconocen el uso de instrumentos en la Instalación Central de Instrumentación Compartida en el Instituto de Medicina Básica y Cáncer (IBMC) de la Academia China de Ciencias. Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC; 82172598), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang, China (LZ22H310001), el Proyecto de Formación de Talentos de Salud 551 de la Comisión de Salud de la Provincia de Zhejiang, China, el Proyecto de Investigación de Desarrollo Agrícola y Social de la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Hangzhou (2022ZDSJ0474) y la Beca de Investigación Interdisciplinaria Qiantang.

NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema del método.
1. Preparación y aislamiento de EM
<ol><li>Internalización celular de MNPs<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Suspender 1 × 106 células madre mesenquimales de médula ósea de rata (BMSC), células 293T o células de cáncer epitelial de ovario de ratón (ID8) en medio completo DMEM con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina-estreptomicina (P/S) al 5 % en 2 ml por placa de seis pocillos (ver Tabla de materiales).</li>
			<li>Cultivar las células durante la noche a 37 °C y 5% de CO2. NOTA: El número de células después de la adherencia fue de aproximadamente 1 × 106.</li>
		</ol></li>
		<li>Endocitosis de MNPs<ol><li>Reduzca el volumen medio de cada placa de seis pocillos a 1 ml. Cocultivar las células con nanopartículas de óxido de hierro (IONPs) modificadas con polilisina de 10 nm (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 100 μg/1 × 106 células e incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga 5% de CO2 durante 12 h para permitir que las células endocitosen completamente los IONP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento y homogeneización de endosomas<ol><li>Tratamiento hipotónico celular<ol><li>Digiera las células que tienen IONPs completamente internalizados con tripsina de 0,5 mL/pocillo durante 3 min, y finalice la digestión añadiendo 1 mL/pocillo de medio completo.</li>
			<li>Centrifugar a 1000 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en solución salina tampón fosfato (PBS) y centrifugar, repetidamente dos veces para lavar el medio residual y los IONP no absorbidos.</li>
			<li>Finalmente, vuelva a suspender el gránulo en 8 mL en una solución hipotónica preparada previamente (71,4 mM de cloruro de potasio, 1,3 mM de citrato de sodio, pH 7,2-7,4) durante 15 min (ver Tabla de Materiales).</li>
		</ol></li>
		<li>Liberación de orgánulos por homogeneización a baja velocidad<ol><li>Transfiera la suspensión celular en solución hipotónica a un tubo de ensayo de vidrio y libere los orgánulos usando un homogeneizador de vidrio (ver Tabla de materiales) mediante 20 choques a 1000 rpm.</li>
		</ol></li>
		<li>Separación magnética para la obtención de endosomas<ol><li>Transfiera 1 ml de la solución celular homogeneizada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquelo en un separador magnético durante 1 h para separar completamente los endosomas cargados de IONP de otros orgánulos (como el núcleo y las mitocondrias) y los desechos celulares.</li>
			<li>Recoja los gránulos marrones en la superficie de contacto de los tubos de microcentrífuga junto al marco magnético (consulte la tabla de materiales), es decir, los endosomas cargados de IONP. Deseche el líquido en los tubos de microcentrífuga y agregue 3 ml de PBS para resuspender los endosomas.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneización de alta velocidad<ol><li>Transfiera la solución que contiene los endosomas a un tubo de centrífuga de 15 ml con un volumen de líquido entre 3 y 10 ml.</li>
		<li>Extienda la sonda de 10 mm del homogeneizador de alta velocidad (consulte la tabla de materiales) hasta el fondo del tubo de centrífuga sin tocar el fondo. Ajuste el botón Velocidad debajo de la pantalla, establezca la velocidad en 140 x g y ajuste el botón Tiempo para establecer el tiempo de 5 minutos, luego presione el botón OK .</li>
		<li>Presione el botón Inicio para realizar la homogeneización después de colocar una caja de hielo debajo de la muestra.</li>
	</ol></li>
	<li>Clasificación magnética para EM<ol><li>Transferir la solución que contiene nanovesículas obtenida de la homogeneización a alta velocidad al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colocarla en un separador magnético durante 1 h.</li>
		<li>Recoja el líquido que contiene los EM requeridos. Tenga cuidado de no tocar la superficie de los tubos junto al marco magnético, que adsorbió IONP libres y EM cargados de IONP.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Caracterización de EM (Figura 2 y Figura 3)
<ol><li>Análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS)<ol><li>Inyecte 1 ml de muestra de EMs (20 μg/ml) a lo largo de la pared en la cubeta y colóquela en la ranura de muestra del instrumento DLS (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Abra el software DLS, seleccione Prueba de tamaño de partícula y comience a probar.</li>
		<li>Mida la concentración de proteínas con un kit de ensayo de proteínas BCA (consulte la tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)<ol><li>Diluir los EM con PBS en una solución a 1 × 107-1 × 108 partículas/ml e inyectarlos en la cámara del instrumento NTA (ver Tabla de materiales) utilizando una jeringa de 1 ml a un caudal de 500-1000 μl/min.</li>
		<li>Abra los 488 canales láser y asegúrese de que el número de EM en la interfaz del software esté dentro de 100-300 y en movimiento browniano.</li>
		<li>De acuerdo con el protocolo del fabricante, seleccione el SOP apropiado (EV-488) para asegurarse de que la sensibilidad del instrumento sea adecuada para la detección de EM.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)<ol><li>Fije los EM (1 mg/mL) con un volumen igual de glutaraldehído al 5% durante 30 min, y cuantifique la concentración de EM como 1 mg/mL mediante el kit de ensayo de proteína BCA.</li>
		<li>Coloque una gota de 10 μL de EM en el lado de carbono de la malla de cobre y elimine el exceso de líquido del lado con papel de filtro después de 10 minutos. Añadir 10 μL de PBS y secar inmediatamente con papel de filtro. Repita dos veces para eliminar el exceso de glutaraldehído.</li>
		<li>Deje caer 5 μL de agente de contraste de acetato de uranilo y tiña negativamente durante 1 minuto, luego retire el exceso de agente de contraste. Lavar tres veces con agua desionizada y secar a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Grabación de imagen por un TEM a una tensión de aceleración de 100 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol><li>Añadir 100 μL de tampón de lisis celular y 5 μL de un cóctel de inhibidores de la proteasa 50x a las muestras (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente con una pistola de pipetas y poner en hielo durante 30 min.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 1000 x g durante 10 min a 4 °C, cuantificar la concentración de proteína del sobrenadante con un kit de ensayo de proteína BCA y recogerla.</li>
		<li>Mezclar el sobrenadante de 100 μL con 25 μL de tampón de carga de proteínas 5x y calentar a 95 °C durante 10 min.</li>
		<li>Prepare los geles de acuerdo con las instrucciones de los geles preformados. Cargue 15 μg de proteína por pocillo y haga funcionar mediante electroforesis en gel a 80 V. Espere a que la muestra corra hacia el gel de separación, cambie a 100 V y luego transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa a 100 V, 60 min bajo baño de hielo.</li>
		<li>Detectar los marcadores no específicos de EV (calnexina) y los biomarcadores de EV (anexina y CD63) mediante Western blot (ver Tabla de materiales). NOTA: Los anticuerpos se diluyen según las recomendaciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Detección de la función EM in vitro 
<ol><li>Etiquetado de EMs<ol><li>Mezclar 1 μL de PKH26 con 250 μL de diluyente C (1:250) para hacer 2x solución de tinción (4 × 10-6 M) (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Mezcle 250 μL de EM (1 mg/mL) con 250 μL de solución de tinción 2x y sople rápidamente con una pistola de pipeteo.</li>
		<li>Incubar en RT durante 2-5 minutos mientras se invierte suavemente el tubo de la centrífuga.</li>
		<li>Añadir un volumen igual de suero o 1% de proteína sérica bovina e incubar durante 1 min para finalizar la digestión.</li>
		<li>Eliminar el exceso de PKH26 mediante ultrafiltración con tubos de ultrafiltración de 1000 KD a 3000 x g durante 30 min, y repetir tres veces añadiendo PBS. Vuelva a suspender el líquido restante a 500 μL con PBS y filtre a través de un filtro de 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de captación de células<ol><li>Inoculación celular: Sembrar 1 × 106 células en placas confocales de 35 mm con 1 mL de DMEM que contenga 10% de FBS y 5% P/S, e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.</li>
		<li>Filtre los EM con filtros de jeringa estériles de 0,22 μm para eliminar la posible contaminación.</li>
		<li>Tratar las células con EM marcadas con PKH26 (109 partículas/ml) durante 8 h.</li>
		<li>Lavar tres veces con PBS, añadir DAPI (10 ng/mL) e incubar durante 10 min a RT.</li>
		<li>Adquiera las imágenes de fluorescencia en microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal utilizando los canales láser de 405 nm y 561 nm (consulte la tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

Producción magnética optimizada de alto rendimiento de nanovesículas derivadas de endosomas

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), eaau6977(2020).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAL-1+controls+multivesicular+body+biogenesis+and+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion.</a> J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).</li>
<li>Farooqi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+biogenesis%2C+bioactivities+and+functions+as+new+delivery+systems+of+natural+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds.</a> Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).</li>
<li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Castilletti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+induction+of+IFN-alpha+and+-gamma+by+SARS-CoV+also+in+the+absence+of+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication.</a> Virology. 341 (1), 163-169 (2005).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines+in+an+evolving+oncology+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape.</a> Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).</li>
<li>Jo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+generation+of+cell-derived+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Large-scale generation of cell-derived nanovesicles.</a> Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nanovesicles+with+sliced+cellular+membrane+fragments+for+exogenous+material+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery.</a> Biomaterials. 59, 12-20 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+ablate+neuroblastoma+tumor+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo.</a> Biomater Adv. 142, 213161(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+deliver+doxorubicin+to+osteosarcoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo.</a> Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+exosome+mimetic+vesicles+and+exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).</li>
<li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+characteristics+of+310+SARS-CoV-2+Omicron+variant+patients+and+comparison+with+Delta+and+Beta+variant+patients+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China.</a> Virol Sin. 37 (5), 12(2022).</li>
<li>Shapira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+platform+for+attenuating+immune+hyperactivity+using+EXO-CD24+in+COVID-19+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond.</a> EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+exosome-mimetic+nanovesicles+for+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+to+malignant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors.</a> ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).</li>
<li>Le, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+mild+isolation+of+intact+lysosomes+using+magnetic-plasmonic+hybrid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles.</a> ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).</li>
<li>Jeong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovesicles+engineered+from+ES+cells+for+enhanced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation.</a> Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).</li>
<li>Kooijmans, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+GPI-anchored+anti-EGFR+nanobodies+on+extracellular+vesicles+promotes+tumour+cell+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting.</a> J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).</li>
</ol>

D.W. y P.G. son coinventores de una solicitud de patente presentada por el Instituto de Medicina Básica y Cáncer (IBMC) de la Academia China de Ciencias. El otro autor declara no tener conflictos de intereses.

Como sustituto de la terapia libre de células y de un sistema de administración de fármacos a nanoescala, los VE aún no han cumplido sus expectativas clínicas, y uno de los principales obstáculos es la falta de métodos de producción y purificación escalables y reproducibles6. Por lo tanto, se han desarrollado varios tipos de EM como análogos de EV con una complejidad biológica similar14. Hasta la fecha, el ejemplo de EM más utilizado son las nanovesículas derivadas de la membrana plasmática celular. La preparación de estas nanovesículas es relativamente fácil y sencilla mediante la extrusión directa de células parentales enteras17. Sin embargo, las nanovesículas derivadas de la membrana plasmática celular no pueden recapitular las VE nativas debido a dos inconvenientes: en primer lugar, el origen biológico de estas nanovesículas proviene de la membrana plasmática celular, que contiene diferentes composiciones de lípidos y proteínas en comparación con las VE nativas; En segundo lugar, las contaminaciones, incluidas las proteínas, los ácidos nucleicos y los lípidos de orgánulos no EV y los desechos celulares, causan una inevitable heterogeneidad de EM. En este método, incubamos células con IONPs y recolectamos endosomas cargados de IONPs a través de la separación magnética, luego generamos nanovesículas monodispersas a través de la homogeneización de alta velocidad, obteniendo finalmente EMs libres de IONP mediante una segunda ronda de separación magnética. Además, optimizamos las condiciones de preparación de EM explorando el impacto de diferentes parámetros, como la velocidad y el tiempo de homogeneización, en el tamaño y el rendimiento de EM. Este protocolo aprovecha un fenómeno biológico interesante: los MNP (por ejemplo, IONP de 10 nm) pueden ser internalizados eficientemente por casi todas las células a través de la endocitosis y acumularse exclusivamente en endosomas, no en otros orgánulos. Este proceso biológico único permitió el aislamiento de endosomas cargados de MNP sin contaminaciones no EV a través de la separación magnética. A cambio, las nanovesículas preparadas por estos endosomas celulares purificados podrían recapitular más fielmente la complejidad biológica de los VE nativos.
Además, el estándar de oro del método de aislamiento EV es la ultracentrifugación, que cuesta medios de cultivo celular masivos y un largo tiempo de procesamiento de más de 5 h y solo produce 1 × 107-1 × 108 partículas a partir de 1 x 10 6 células6. Los métodos tradicionales de extrusión de células parentales enteras incluyen múltiples pasos que involucran extrusión por membrana de ultra alta presión y ultracentrifugación, que tienen un rendimiento relativamente mayor pero requieren equipos costosos17. Sin embargo, el rendimiento, la eficiencia, el costo y la mano de obra de la producción de EM mejoran sustancialmente al utilizar nuestro protocolo. El homogeneizador de alta velocidad es un equipo común y de bajo costo para un tiempo de procesamiento corto de 5 minutos en este protocolo, y este método puede producir hasta 100 veces más EM de 1 × 106 celdas en comparación con los EV nativos. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones, como la pérdida de proteínas endosomales durante la homogeneización a alta velocidad, y se ha demostrado que los MNPs endocitados por las células pueden ser transferidos a los lisosomas, lo que sería una contaminación potencial18.
En perspectiva, los ME pueden ser diseñados para ejercer funciones biológicas importantes como sus contrapartes nativas, lo que puede servir como un tipo novedoso y prometedor de terapias biológicas. Las sustancias bioactivas (p. ej., proteínas y ácidos nucleicos) pueden integrarse en las EM mediante la selección de células parentales específicas (p. ej., células madre19) o modificación genética (p. ej., proteínas de fusión20). Por ejemplo, las nanovesículas derivadas de células mediante la extrusión de células madre embrionarias vivas tienen un efecto positivo en el proceso de recuperación o cicatrización de heridas19. La modificación genética es un enfoque alternativo para generar ME con funciones biológicas específicas. Por ejemplo, cuando las células se transfectaron con vectores de nanocuerpos anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) fusionados con péptidos de señal de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI), los nanocuerpos de EGFR se pueden anclar en la superficie de los EV para dirigirse a las células tumorales que expresan EGFR20. Los ME han funcionado bien como sustitutos de la terapia libre de células y un sistema de administración de fármacos a nanoescala en múltiples estudios preclínicos14, pero existe una falta de una comprensión mecanicista integral de la terapia basada en ME o EV con preocupaciones sobre la heterogeneidad y la reproducibilidad de los ME y los ME en las investigaciones clínicas. En conjunto, las funciones biológicas de los ME y sus implicaciones clínicas justifican nuevas investigaciones.

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas vesículas secretadas por casi todas las células con un rango de tamaño de 30-150 nm, que contienen abundantes sustancias bioactivas. Dependiendo de la célula de origen, las VE muestran una alta heterogeneidad, poseyendo múltiples componentes específicos de las células parentales1. Las VE se liberan en los fluidos corporales y se transportan a sitios distantes donde son absorbidas por las células diana para la acción2, que se puede utilizar para administrar una amplia gama de moléculas bioactivas y fármacos para la reparación de tejidos, el diagnóstico y tratamiento de tumores y la modulación inmunitaria 3,4. Sin embargo, otras nanopartículas biológicas (p. ej., lipoproteínas) y nanovesículas (p. ej., VE derivadas de vías no endosomales) con propiedades biofísicas similares en los fluidos corporales afectan inevitablemente al aislamiento y la purificación de las VE. Hasta la fecha, la ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de EV, y se han desarrollado otros métodos de aislamiento, incluida la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, la ultrafiltración, la precipitación de polietilenglicol, la cromatografía y el aislamiento inmunomagnético de perlas5. El cuello de botella actual que limita la traslación clínica y la comercialización de las terapias con VE es la grave falta de técnicas de aislamiento que permitan el aislamiento altamente escalable y reproducible de las VE 6,7,8. Las técnicas tradicionales de aislamiento de VE (p. ej., ultracentrifugación y cromatografía de exclusión por tamaño) adolecen de bajo rendimiento (1 x 107-1 x 108/1 x 106 células), largo ciclo de producción (24-48 h), escasa reproducibilidad de la calidad del producto y requieren equipos de producción caros y que consumen mucha energía y no pueden satisfacer la demanda clínica actual de VE6.
Los imitadores de exosomas (EM), sustitutos sintéticos de los EV nativos, han atraído una atención importante debido a su estructura, función y escalabilidad altamente similares en la producción. La principal fuente de EM proviene de la extrusión directa de células parentales enteras con seccionamiento continuo 9,10, demostrando potentes funciones biológicas como EV nativas11,12. Por ejemplo, las ME derivadas de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUCMSC) ejercen efectos de cicatrización de heridas similares a los de las VE nativas y son más ricas en composición proteica13. Aunque los ME derivados de células enteras tienen la complejidad biológica de los VE, su principal inconveniente es la heterogeneidad de los productos, ya que están inevitablemente contaminados por varios orgánulos celulares y restos celulares. El análisis de localización de proteínas reveló además que las ME derivadas de la extrusión de células enteras contienen muchas proteínas no específicas de las VE de las mitocondrias y del retículo endoplásmico13. Además, la mayoría de los métodos de fabricación de EM siguen requiriendo la ultracentrifugación, un proceso que consume mucho tiempo y energía14. Teniendo en cuenta el hecho de que los exosomas se derivan exclusivamente de endosomas celulares, planteamos la hipótesis de que las nanovesículas derivadas de endosomas de bioingeniería pueden recapitular mejor la homología biológica entre exosomas y EM en comparación con los EM derivados de la membrana celular bien establecidos producidos por el método de extrusión de células completas14. Sin embargo, la fabricación de nanovesículas derivadas de endosomas es difícil debido a la falta de enfoques viables.
Se han llevado a cabo estudios clínicos utilizando VE como sustituto de la terapia libre de células y un sistema de administración de fármacos a nanoescala para el tratamiento de diversas enfermedades. Por ejemplo, las VE derivadas de células madre mesenquimales de la médula ósea se han utilizado para tratar la neumonía grave causada por la COVID-19 y han logrado resultados prometedores. Recientemente, los VE modificados genéticamente que transportan proteínas CD24 también han demostrado potentes beneficios terapéuticos para el tratamiento de pacientes con COVID-1915,16. Sin embargo, el requisito clínico de la terapia EV aún no se puede cumplir con los métodos de aislamiento tradicionales debido al bajo rendimiento y costo. Este estudio informa de la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas a través de un enfoque de homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética. Aprovecha la vía de endocitosis de los MNP para aislar endosomas cargados de MNP mediante separación magnética, seguida de homogeneización de alta velocidad para formular endosomas en nanovesículas monodispersas. Dado que los tipos de endosomas recolectados por este protocolo son diversos, aún se requiere una investigación más profunda para establecer buenas prácticas de fabricación (GMP) en la industria. Este novedoso enfoque de preparación de EM es más eficiente en el tiempo (5 min de homogeneización a alta velocidad) para obtener nanovesículas homólogas a los EV nativos. Produce exponencialmente más vesículas a partir de la misma cantidad de células que la ultracentrifugación, que generalmente se puede aplicar a varios tipos de células.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo de anexina</td><td>ABclonal</td><td>A11235</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>kit de ensayo BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>Ensayo de concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>GeneTex</td><td>HL1598</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo CD63</td><td>ABclonal</td><td>A19023</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tampón de lisis celular para Western e IP</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western Centrífuga de cloción</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>celular Incubadora de CO2</td><td>Thermo</td><td></td><td>Cell</td></tr><tr><td>Cultivo Confocal de escaneo láser</td><td>NIKON</td><td>A1 HD25</td><td>Photo la imagen de fluorescencia</td></tr><tr><td>DMEM basic (1x)</td><td>GIBCO</td><td>C11995500BT</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de la luz (DLS)</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN3600</td><td>Análisis de diámetro</td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidrio eléctrico</td><td>SCIENTZ(Ningbo, China)</td><td>DY89-II</td><td>Homogeneización a baja velocidad</td></tr><tr><td>Sistema FBS empobrecido en exosomas</td><td>Bioscience</td><td>EXO-FBS-50A-1</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Homogeneizador de alta velocidad</td><td>SCIENTZ(Ningbo, China)</td><td>XHF-DY</td><td>Homogeneización a alta velocidad</td></tr><tr><td>Rejilla magnética</td><td>Tecnología electromecánica Tuohe (Shanghái, China)</td><td>NA</td><td>Separación magnética</td></tr><tr><td>PKH26 Kit de enlazador de celdas fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>El kit contiene un enlazador de celdas PKH26 en etanol y un diluyente C</td></tr><tr><td>Nanopartículas de óxido de hierro modificado con polilisina (IONPs)</td><td>Zhongke Leiming Technology (Pekín, China)</td><td>Mag1100-10</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Potasio cloruro</td><td>Aladdin</td><td>7447-40-7</td><td>Tratamiento hipotónico celular</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Beyotime</td><td>P1030</td><td>Inhibidor de la proteinasa</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Aladdin</td><td>7447-40-7</td><td>Tratamiento hipotónico celular</td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)</td><td>JEOL</td><td>JEOL-2100plus</td><td>Morfología de la imagen</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima Centrífuga de exosomas XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>ZetaView Analizadores de seguimiento de nanopartículas&nbsp;</td> Análisis de <td>seguimiento de nanopartículas</td> <td>Component Metrix</td><td>PMX120</td></tr></tbody></table>

un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles

Las vesículas extracelulares (VE) han atraído una atención significativa en la investigación fisiológica y patológica, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades; Sin embargo, su traslación clínica se ha visto limitada por la falta de enfoques de fabricación a escala. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) derivados de los endosomas, que tienen un rendimiento aproximadamente 100 veces mayor que el método de ultracentrifugación convencional. En este método, las nanopartículas magnéticas (MNP) fueron internalizadas por las células parentales a través de la endocitosis y posteriormente se acumularon dentro de sus endosomas. A continuación, se recogieron los endosomas cargados de MNPs y se purificaron mediante tratamiento hipotónico y separación magnética. Se utilizó un homogeneizador de alta velocidad para romper los endosomas cargados con MNP en nanovesículas monodispersas. Las vesículas derivadas del endosoma resultantes presentan el mismo origen biológico y estructura, caracterizadas por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el microscopio electrónico de transmisión y la transferencia occidental. Su morfología y composición proteica son similares a las de los VE nativos, lo que indica que los ME pueden servir potencialmente como un sustituto de bajo costo y alto rendimiento de los VE nativos para traducciones clínicas.

En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo de la preparación EM mediante homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética. Las células internalizan IONP modificados con polilisina de 10 nm, que se acumulan específicamente en los endosomas a través de la endocitosis (Figura 3A). Después de ser tratados con tampón hipotónico y homogeneizados, los endosomas cargados de IONP se liberan de las células y posteriormente se recogen por separación magnética. Los endosomas aislados se reconstituyen en nanovesículas monodispersas, también conocidas como EM, mediante homogeneización a alta velocidad. Exploramos múltiples parámetros clave (p. ej., velocidad y tiempo de homogeneización) para identificar las condiciones optimizadas de preparación de EM (Figura 2). Finalmente, se eligió una velocidad de homogeneización de 140 x g durante 5 min como condición optimizada teniendo en cuenta el tamaño de partícula y el rendimiento de los EM producidos. Los IONP libres y los ME cargados de IONP se eliminan finalmente de la solución del producto final mediante una segunda ronda de separación magnética para obtener EM libres de IONP. El método produce nanovesículas altamente uniformes y monodispersas a partir de endosomas de células parentales, que comparten el mismo origen biológico que los VE nativos.
Para comparar los VE obtenidos por ultracentrifugación con los ME generados por este método, se prepararon BMSC y 293T para VE y EM. El diámetro y la morfología de los EM se analizaron mediante NTA y TEM. La morfología de los BMSC-EM tiene la característica de una estructura típica en forma de vesícula en forma de cuenco y está delimitada por una bicapa lipídica (Figura 3A). Según lo analizado por NTA, tanto los BMSC-EM como los 293T-EM tienen un diámetro hidrodinámico similar al de los EV nativos (BMSC-EV y 293T-EV) (Figura 3B). Los rendimientos de homogeneización a alta velocidad de los BMSC-EM fueron de 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 células, y el rendimiento de los EV nativos preparados por ultracentrifugación fue de solo 7,2 × 10 7-1,12 × 10 8/1 × 106células. De manera similar, los rendimientos de homogeneización de alta velocidad de 293T-EM fueron de 3.71 × 10 8-7.58 × 108/1 × 10 6 celdas, lo que alcanza hasta aproximadamente 100 veces mayor que los de las 293T-EV nativas preparadas por el método de ultracentrífuga convencional (≈5.5 × 10 6/1 × 10 6celdas) (Figura 4A).
Además, los resultados de Western blot mostraron que los BMSC-EM contienen los mismos biomarcadores proteicos que los EV (CD63 y anexina). Tanto los ME como los VE son negativos para la expresión de calnexina, lo que sugiere que los ME producidos por este método casi no tenían contaminación de la membrana plasmática (Figura 3C). No hay diferencias significativas en la concentración de proteínas entre EM y EV, los BMSC-EM y los BMSC-EV exhibieron concentraciones de proteínas totales similares, 11,15 μg/1 × 10 9 partículas y 14,71 μg/1 × 109 partículas a través del kit de ensayo de proteínas BCA. Además, los 293T-EM y 293T-EV mostraron concentraciones totales de proteínas de aproximadamente 31,8 μg/1 × 10 9 partículas y 9,95 μg/1 × 109 partículas, respectivamente (Figura 4B). Estos resultados indican que los ME tienen una composición proteica similar a la de los VE nativos. Para detectar si los ME pueden ser endocitosados, los ME y los VE marcados con PKH26 se co-incubaron con BMSC e ID8 a una concentración de 1 × 109 partículas/ml durante 8 h, y las células se observaron bajo microscopía de fluorescencia confocal para confirmar que las ME podían ser fácilmente absorbidas por las células para la acción, así como los VE (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático del método de homogeneización de alta velocidad asistido por magnetismo. Paso 1: Las células internalizan los IONP en los endosomas a través de la endocitosis. Paso 2: Recolectar orgánulos, incluidos los endosomas cargados de IONP, después del tratamiento hipotónico y la homogeneización. Paso 3: Purificar los endosomas cargados de IONP mediante separación magnética. Paso 4: Los endosomas se homogeneizan y se reconstituyen en nanovesículas monodispersas. Paso 5: Elimine los IONP libres y los ME cargados de IONP mediante separación magnética para recolectar los ME libres de IONP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig02v2.jpg"> Figura 2: Optimización de las condiciones de preparación de EM. (A) El diámetro y el PDI de los BMSC-EM en respuesta a los cambios en la velocidad de homogeneización cuando el tiempo se establece en 5 min se analizaron mediante DLS. (B) El diámetro y el PDI de los BMSC-EM en respuesta a los cambios en el tiempo de homogeneización cuando la velocidad de homogeneización se establece en 140 x g se analizaron mediante DLS. (C) El diámetro y el PDI de los BMSC-EM en diferentes puntos de tiempo de almacenamiento fueron analizados por DLS. (D) El diámetro y la concentración de BMSC-EM en respuesta a los cambios en la velocidad de homogeneización cuando el tiempo se establece en 5 min se analizaron mediante NTA. (E) El diámetro y la concentración de BMSC-EM en respuesta al cambio de tiempo de homogeneización cuando la velocidad de homogeneización se establece en 140 x g se analizaron mediante NTA. (F) El diámetro y el rendimiento de los BMSC-EM en respuesta a la co-incubación de las células BMSC con IONPs de diferentes concentraciones fueron analizados por NTA. p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig03.jpg"> Figura 3: Caracterización de las EM. (A) Caracterización TEM de la morfología de las células parentales con IONPs, endosomas y EMs endocitos. Las barras de escala representan 500 nm. (B) Los diámetros hidrodinámicos de BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM y 293T-EV se caracterizan por NTA. (C) Resultados del análisis de Western blot de BMSC-EM, BMSC-EV y lisados de células BMSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig04.jpg"> Figura 4: El rendimiento de los ME es mayor que el de los EV. (A) El rendimiento de los ME y EV preparados a partir de BMSC y 293T fue analizado por NTA. (B) Rendimiento proteico de los ME y EV preparados a partir de BMSC y 293T. **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes representativas del microscopio fluorescente de los EV y EM marcados con PKH26 internalizados por BMSC e ID8. Las barras de escala representan 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.

Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

Extracellular vesicles (EVs) have attracted significant attention in physiological and pathological research, disease diagnosis, and treatment; however, ...

En este estudio, tratamos de abordar una necesidad crítica no satisfecha en la investigación de exosomas, que es el desarrollo de un método de producción a gran escala y reproducible para miméticos de exosomas. Debido a la noción de evasiones nativas, los miméticos de exosomas, EMS, se han producido como sustitutos mediante métodos como la exclusión real y la filtración basada en ultracentrifugación. Ciertamente, la mayoría de los miméticos de exosomas provienen de la exclusión directa de células enteras, lo que demuestra funciones biológicas mínimas, pero están inevitablemente contaminados por restos celulares y orgánulos.Las vesículas extracelulares han atraído una atención significativa en la investigación biomédica, especialmente en el tratamiento de enfermedades. Sin embargo, las técnicas tradicionales de aislamiento de vehículos eléctricos, como la filtración ultrasensible, la exclusión interna y los glifos catamentales, parten de una baja productividad de bajo rendimiento de la calidad del arado y requieren equipos de producción costosos e intensivos de ingeniería que no pueden satisfacer la demanda clínica de vehículos eléctricos. Nuestro estudio proporcionó un método simple y sin costo para la producción de exploración de miméticos de exosomas.Aprovechamos el hallazgo biológico único de que las nanopartículas magnéticas solo pueden donarse dentro de los endosomas celulares, no dentro de otros orgánulos. Por lo tanto, podemos formular los endosomas en nanosescosa uniforme. Este método mejora efectivamente el EME y reduce los costos.

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Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

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