Un flujo de trabajo basado en la web para seleccionar potenciadores específicos de genes y tejidos

Estamos interesados en decodificar el genoma no codificante para comprender cómo se regulan los genes, para expresarlos en el momento y lugar adecuados. Desarrollamos protocolos fáciles de usar utilizando herramientas genómicas basadas en la web para hacer que el descubrimiento mejorado sea accesible para todos los biólogos. Amplia disponibilidad de datos multimodales que pueden ayudar a reducir la ubicación de los potenciadores y el fácil acceso a estos datos a través de interfaces web de código abierto.

Esto permite una identificación integral de potenciadores sin necesidad de experiencia en programación por parte de los investigadores. Este protocolo proporciona una base para que cualquier persona sin experiencia en biología de potenciadores comience a navegar por conjuntos de datos disponibles públicamente para recuperar potenciadores para los genes de interés. Utilizamos TBX5, un conocido actor en biología del corazón, como estudio de caso.

Nuestro flujo de trabajo identificó 21 potenciadores, que pueden arrojar luz sobre los mecanismos de desarrollo del corazón y las cardiopatías congénitas. Ampliaremos nuestro protocolo con nuevas fuentes de datos, incluida la genómica espacial, mientras desarrollamos herramientas adicionales fáciles de usar para los biólogos. Para comenzar, abra el navegador del genoma de Ensembl.

Seleccione el ensamblaje del genoma que coincida con la especie y la versión de interés. Ingrese el gen de interés en el campo de búsqueda y haga clic en Ir.En los resultados, haga clic en el ID de gen de ensamblaje apropiado.Luego desplácese hasta la sección Resumen y haga clic en el enlace Región en detalle" para visualizar la región circundante del gen de interés. Ahora, busque los dos genes que flanquean el gen de interés utilizando la pista Gene Legend.

Estos genes aparecen como elementos visuales que representan anotaciones fusionadas de Ensembl y Havana dentro de las anotaciones genéticas básicas de la pista GENCODE. Determine la direccionalidad del gen de interés observando los signos mayor o menor que junto a los nombres de los genes. Haga clic y arrastre el cursor a través de la región intergénica entre estos genes, luego haga clic en Saltar a la región "en el cuadro emergente para ver la región seleccionada.

Personalice la visualización haciendo clic en Agregar" o Eliminar pistas" en la parte superior del visor de pistas. Utilice los controles de zoom y navegación para ajustar la vista y mejorar la visualización de la región. En el visor de pestañas Región en detalle, haga clic en Configurar esta página, en la barra lateral.

En la barra lateral Configurar imagen de región", en Regulación, seleccione Actividad por célula o tejido. Use la barra de búsqueda de celdas o tejidos para encontrar y seleccionar los tejidos deseados, o use el índice alfabético debajo de la barra. Haga clic en la pestaña "Experimentos" adyacente a la opción Célula o tejido".

Elija H3K4me1 y H3K27ac como marcador para potenciadores y H3K4me3 como marcador para promotores y haga clic en Configurar visualización de pista. Luego, seleccione Ver pistas" para visualizar las regiones marcadas por H3K4me1 dentro de la región de detección del potenciador y las regiones marcadas por H3K4me3 aguas arriba del gen de interés. Haga clic en los elementos visuales o de cuadro de color en la pista H3K4me1 para recuperar las coordenadas genómicas de las regiones marcadas dentro de la región de detección definida.

Esto abre la ventana emergente Hists y Pols, que muestra la ubicación genómica del elemento en pares de bases. Alternativamente, defina manualmente las regiones de interés para cada característica genómica haciendo clic y arrastrando en la pista para incluir picos de gráficos en las pistas H3K4me1 o H3K27ac. Luego copie las coordenadas de ubicación genómica en un archivo de texto y guarde el archivo en formato BED.

Acceda al portal de datos 4DN. En la página de inicio, asegúrese de que Conjuntos de experimentos" esté seleccionado como el eje Y de la barra apilada principal, Tipo de experimento "esté seleccionado como eje X y que el gráfico esté agrupado por organismo. Ubique la barra In Situ Hi-C a lo largo del eje X y haga clic en la parte que representa los conjuntos de experimentos humanos.

En la ventana emergente, haga clic en el botón Examinar y seleccione mioblastos del músculo cardíaco y nuestro gen de interés, TBX5, asociado con la organogénesis del corazón. Haga clic en el enlace en la columna "Título" de la muestra biológica correspondiente al tejido de interés. A continuación, en la pestaña Archivos procesados, haga clic en Explorar datos" para examinar el conjunto de datos Hi-C con más detalle.

Introduzca las coordenadas del promotor identificado en el tejido de interés y haga clic con el botón derecho en el mapa de calor para marcar la región horizontalmente. Estas líneas permiten realizar un seguimiento visual de la región promotora en el mapa de calor. Si es necesario, ajuste la vista arrastrándola verticalmente hasta que los límites superior e inferior de las coordenadas Y de la barra de búsqueda se alineen con los límites de la región de interés.

Para eliminar las líneas no deseadas, haga clic con el botón derecho en la línea y seleccione "Horizontal" o "Regla vertical", luego haga clic en Cerrar serie. Introduzca las coordenadas de todos los potenciadores de control validados experimentalmente para calcular el umbral de interacción en función de sus valores mínimos de interacción. Muestre los tres potenciadores de control de la literatura junto con la región promotora de Ensembl utilizando la vista preparada previamente.

A continuación, defina el umbral del potenciador del promotor utilizando estos potenciadores de control seleccionando la puntuación de interacción distinta de cero más baja como lo indica la clave de color en el lado derecho de la matriz del mapa de calor. Introduzca las coordenadas genómicas de todas las regiones potenciadoras asociadas a H3K4me1 y marque verticalmente en el mapa de calor Hi-C. Filtre las regiones que interactúan débilmente comparando las puntuaciones de interacción de las regiones marcadas con H3K4me3 con el umbral de interacción.

Seleccione las coordenadas genómicas que muestran las frecuencias de interacción por encima de este umbral, que aparecen como señales más concentradas o más oscuras en el mapa de calor, y guárdelas en formato BED. Tres de los cuatro potenciadores cardíacos identificados en el navegador VISTA Cardiac Enhancer, HS2329, mm1282 y mm370, se superpusieron con regiones predichas por el protocolo de detección de potenciadores basado en la web. El potenciador dos se superpuso con una región predicha por el protocolo de detección del potenciador y un potenciador validado experimentalmente.

El potenciador 16 mostró superposición tanto con las regiones potenciadoras predichas como con los datos experimentales anteriores. Enhancer Nine no se superpuso con ningún potenciador predicho de la tubería, pero mostró un enriquecimiento parcial de la señal H3K4me1.