Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

El objetivo general de este video es proporcionar un conjunto integrado de métodos para identificar y validar experimentalmente los elementos reguladores geneómicos, los llamados potenciadores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la transcripción y regulación de eventos biológicos, incluida la selección y el uso de potenciadores, el uso de la diferenciación celular o en respuesta a estímulos externos. La principal ventaja del flujo de trabajo presentado es que un protocolo puede adaptarse y utilizarse fácilmente en cualquier sistema modelo celular.

Demostraré los pasos del procedimiento. Para empezar, elija un candidato a potenciador basado en un análisis de secuenciación de chips preexistente. Utilice un navegador de genoma para ver los resultados del experimento de secuenciación de chips deseado e identifique los sitios de unión en las proximidades del gen de interés.

Elija Definir una región de interés para obtener una secuencia de pares de bases de 200-400 de la región genómica seleccionada y utilice las secuencias para el diseño posterior del cebador. Con técnicas estándar de biología molecular, amplifique y clone la región genómica seleccionada en una construcción de plásmido reportero. Para probar la actividad potenciadora, transfecte las construcciones reporteras en células madre embrionarias masivas agregando primero 200 microlitros de solución de gelatina al 0,1% por pocillo a 48 placas de pocillos.

Incube las placas durante 30 minutos antes de enchapar. El día antes de la transfección, placa madre embrionaria libre de alimentador, o células ES, en 250 microlitros de medio ES a una densidad de tres veces 10 a la cuarta célula por pocillo. El día de la transfección, prepare las mezclas de plásmidos, haciendo suficiente para ocho pocillos de cada mezcla.

Agregue medio sérico reducido de calidad de transfección a cada mezcla de plásmidos para aumentar el volumen hasta 106 micro litros. A continuación, añada 4,5 microlitros de reactivo de transfección de calidad ES y mezcle cuidadosamente pipeteando 15 veces hacia arriba y hacia abajo. Incubar la mezcla de transfección durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, agregue 13 microlitros por pocillo de la mezcla de transfección a las celdas y mezcle bien mediante pipeteo. Luego, vuelva a colocar las células en la incubadora durante la noche antes del tratamiento con líquenes. La eficiencia de la transfección es un paso crítico.

Si se utiliza otro tipo de celda, este paso requiere optimización. Utilice el tipo de celda más relevante para probar la actividad del potenciador y minimizar los efectos dependientes del contexto. Al día siguiente, retire cuidadosamente el medio por aspiración y agregue 250 microlitros de medio fresco por pocillo que contenga un micromolar de ácido transretinoico, o DMSO como vehículo.

Incubar las células durante 24-48 horas. Después de preparar el tampón de lisis de acuerdo con el protocolo de texto, aspire con cuidado el medio de las células. Use 1X PBS para elevar las celdas una vez, luego agregue 200 microlitros de tampón de lisis 1X por pocillo.

Agite las células a temperatura ambiente durante dos horas. Luego, para una lisis celular completa, congele los lisados celulares en la placa a 80 grados Celsius. Después de descongelar completamente los lisados, use una pipeta electrónica multicanal para transferir 80 microlitros del lisado celular a una placa transparente de 96 pocillos para la beta galactosidasa, y 40 microlitros del lisado a una placa blanca para la medición de luciferasa.

Para llevar a cabo la beta galactosidasa, mezcle un mililitro del tampón de sustrato beta gal con cuatro miligramos de OMPG. A continuación, añada 3,5 microlitros de beta mercaptoetanol a la mezcla e inmediatamente añada 100 microlitros del tampón a los 80 microlitros de lisado celular. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados hasta que se desarrolle el tenue color amarillo.

Lea la absorbencia a 420 nanómetros en un lector de placas y exporte los datos. Para realizar el ensayo de luciferasa, después de preparar el reactivo de sustrato de acuerdo con el protocolo de texto, caliente el reactivo de sustrato de luciferasa a temperatura ambiente antes de comenzar. A continuación, pipetee 100 microlitros en cada pocillo de la placa blanca que contiene los 40 microlitros de lisado celular.

Utilice inmediatamente una máquina contadora luminiscente para medir la señal. Obtener las actividades de al menos tres transfecciones y experimentos independientes. Realice cálculos para ambos ensayos de acuerdo con el protocolo de texto.

Para diseñar los cebadores para la detección de ARNe mediante RTCPR, seleccione una región genómica que esté al menos a 1,5 a dos kilo bases de distancia de cualquier transcripción de genes anotada. Identifique la dirección relativa del gen y determine la posición de las transcripciones de sentido y antisentido. Para diseñar cebadores para la cuantificación del ARN potenciador, elija regiones 200-1.000 pares de bases desde el centro del sitio de unión del factor de transcripción.

Si el gen se encuentra en la cadena negativa, copie 200-300 pares de bases de la cadena positiva y convierta la secuencia para obtener la secuencia inversa del complemento. A continuación, utilice esta secuencia para el diseño posterior de la imprimación. Establezca el rango de tamaño del producto entre 80 y 150 pares de bases.

Para medir la transcripción de ARNe, después de aislar el ARN total de las células tratadas de acuerdo con el protocolo de texto, detecte el ARNe transcrito inverso mediante RTCPR utilizando un procedimiento estándar. Mida un ARNm no dependiente del tratamiento para la normalización. Como se muestra aquí, el análisis bioinformático de los datos de secuenciación del chip RXR obtenidos de células madre embrionarias tratadas con ácido retinoico reveló el enriquecimiento de la mitad del sitio del receptor nuclear debajo de los sitios ocupados por RXR.

Utilizando un algoritmo bioinformático, los resultados de la búsqueda de motivos para el medio sitio se asignaron a los datos de secuenciación del chip RXR. Este análisis identificó picos de chips que se superponen con los sitios de unión de receptores nucleares canónicos. La visualización de los sitios en IGV indicó un enriquecimiento de los factores de transcripción cercanos a Hoxa1.

Un objetivo RAR RXR previamente caracterizado. También se identificó un potenciador punitivo para una nueva cadena diana de AR, PRMT8. Las regiones potenciadoras identificadas se clonaron en el vector indicador de luciferasa TK, y las células madre embrionarias se transfectaron con estas construcciones.

La actividad de la luciferasa se midió en ausencia y presencia de AR. Los constructos que contenían el elemento de respuesta a la AR, o RARE, mostraron un aumento de la intensidad de la señal de luciferasa tras el tratamiento con AR, mientras que el constructo sin el RARE no fue inducido. Para determinar si la expresión de eRNA sentido y antisentido del potenciador unido a Hoxa1 RAR RXR se correlaciona con la expresión de ARNm del gen, también se midió el nivel de eRNA de Hoxa1. Los resultados confirmaron que la actividad potenciadora es inducida por el tratamiento a corto plazo con AR.

Una vez dominada, esta carga de trabajo se puede realizar en unos pocos días mediante la realización del experimento de trampa potenciadora descrito y la cuantificación del potenciador, se puede proporcionar una fuerte evidencia funcional de la actividad del potenciador. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo identificar y caracterizar los potenciadores punitivos. Una vez que se identifica y valida un potenciador, se pueden realizar otros métodos, como la captura de confirmación cromosómica o CCC, para responder a preguntas importantes adicionales, como ¿qué gen está regulado por el potenciador validado?