Name: Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a identificar y validar elementos reguladores genómicos llamados potenciadores mediante análisis ChIP-seq y ensayos de luciferasa en células madre embrionarias. Este protocolo adaptable permite estudiar la regulación transcripcional durante la diferenciación celular.

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Los autores desean agradecer al Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint y miembros del laboratorio Nagy por sus discusiones y comentarios sobre el manuscrito. L.N cuenta con el apoyo de subvenciones del Fondo Húngaro de Investigación Científica (OTKA K100196 y K111941) y cofinanciado por el Fondo Social Europeo y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el Programa Húngaro de Investigación del Cerebro - Subvención No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Selección del reforzador basado en el análisis de Chip-ss <ol><li> Descargar el archivo de datos en bruto FASTQ RXR chip-ss (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) de http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Descargar y extraer el archivo de índice BWA requerida para la alineación (en nuestro caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz NOTA: Visita a https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts para obtener más información con respecto a las etapas de análisis de la bioinformática y para descargar los scripts utilizados a continuación. </li><li> Alinear el archivo de ejemplo FASTQ al genoma mm10 (utilizar el script: perform_alignment.sh). Esto creará una carpeta con un archivo .bam y estadísticas de la alineación. los datos de chip-ss RXR alineados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), y el archivo de índice correspondiente (.bai) están disponibles aquí: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ NOTA: ABM es un paquete de software que se alinea relasecuencias relativamente cortas (por ejemplo, resultados de chip-ss) a una base de datos de secuencia, como la referencia del genoma del ratón (por ejemplo, mm10) 13. </li><li> Ejecutar el script (callpeaks.sh) para realizar llamadas de pico y de novo motivo de análisis. Utilice el archivo .bam que la entrada. El guión se basa en Homer findPeaks 14. NOTA: Los archivos de salida nos dan información sobre el número total de picos, el enriquecimiento de los motivos, el porcentaje de los antecedentes, y las secuencias diana con motivos, etc. (Figura 1). Por lo general varios motivos se enumeran en orden de su importancia. </li><li> Reasignar el # 1 clasificado con motivos (NR mitad `AGGTCA`) (utilizar el script: remap_motif.sh) NOTA: Como el resultado, el script genera un archivo .bed que mostrará los cuales chip-picos están cubriendo las regiones genómicas que contienen el sitio de unión canónica del factor de transcripción de interés. </li><li> Descargar y visualizar los resultados de la RXR lee el chip-ss alineados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (también descargar el .bai)) y las ocurrencias AGGTCA motivo (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) por Integrativa Genómica Visor (IGV) 15 para identificar putativo RAR / RXR sitios de unión (Figura 2 y Figura 3). NOTA: La integración de diversos datos de chip-ss ayudará a predecir con precisión más potenciadores buenos candidatos 16,17. Estudios recientes revelaron que los potenciadores activos se enriquecen típicamente para P300 y se correlacionan con H3K4me1 y H3K27ac, y se encuentran en las regiones de cromatina abierta, mostrando de ese modo la ADNasa-I hipersensibilidad también se recomienda 18-21. </li><li> Utilice la opción &quot;Definir una región de interés&quot; en el IGV 15 para obtener 200 - secuencia 400 pb de la región genómica seleccionado y utilizar estas secuencias para los diseños de cebadores siguientes. </li></ol> 2. Ensayo Reportero NOTA: Se aplica el sistema luciferina / luciferasacomo un ensayo de indicador muy sensible para la regulación transcripcional. Dependiendo de la enzima luciferasa potenciador de la actividad se produce que catalizará la oxidación de luciferina a oxiluciferina resultante en bioluminescense, que puede ser detectado. Como primer paso, secuencias potenciadoras putativos identificados deben ser subclonados en un vector reportero (por ejemplo, TK-luciferasa 22, pGL3 o NanoLuc). <ol><li> Diseño de cebadores <ol><li> Diseño cebadores de PCR para la amplificación de 200 - 400 pb de las regiones de potenciador putativo por Primer3 (disponible aquí: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copiar y pegar la secuencia genómica del IGV que incluye el supuesto sitio de unión en Primer3 (véase el paso 1.7). Conjunto rango de tamaño del producto a 250 - 300 pb en Primer3. </li><li> Validar los cebadores de PCR utilizando la UCSC Genome Browser es in silico herramienta de PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 NOTA: Este protocolo en un paso posterior utiliza HindIIrestricción BamHI I y enzimas para la clonación. Comprobar si la secuencia amplificada por PCR según lo predicho por la herramienta de PCR UCSC in silico, contendrá AAGCTT o GGATCC sitios de restricción (por ejemplo, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> Obtener los cebadores necesarios de un proveedor comercial. </li></ol></li><li> Amplificación por PCR de potenciador de la secuencia de ADN genómico <ol><li> Purificar plantilla de ADN genómico a partir de células primarias (por ejemplo, fibroblastos embrionarios primarios). Utilice kit comercial para el aislamiento ADNg y siga las instrucciones del fabricante. NOTA: La alta calidad de ADNg es esencial para el éxito de la amplificación por PCR. clones BAC apropiados pueden ser utilizados si la PCR no es fácil de gDNA. </li><li> Preparar 50 l de reacción de PCR que contiene 100 ng de ADNg, 5 l de 10x tampón, 3 l MgSO4 (25 mM), dNTP 5 l (2 mM cada uno), 1,5 l del Fwd imprimación (10 mM), 1,5 l de cebador Rev (10 M) , 1 l de ADN polimerasa <li> Ajuste el ciclo de PCR (2 minutos a 95 ° C, (20 seg 95 ° C, 10 seg 58 - 65 ° C, 18 seg 70 ° C) de repetición x25, 2 min 70 ° C, para siempre 4 ° C). Ajuste la temperatura de recocido con la consideración de la imprimación de predecir valores de Tm. </li><li> Se purificó el producto de PCR con un kit de purificación de PCR comercial y siga las instrucciones del fabricante. </li><li> Introducir los sitios de restricción para la clonación mediante la repetición de la PCR con cebadores tal como se utiliza anteriormente, pero la adición de salientes en sus extremos 5 &#39;(por ejemplo, Fwd: 5&#39;-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3&#39; (HindIII), Rev: 5&#39;-TATA GGATCC XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3 &#39;(BamHI)). </li><li> Funciona con 5 l de producto de PCR en gel de agarosa para comprobar si los productos de PCR inespecíficos. NOTA: Si se detectan más bandas, correr todo el producto de la PCR y purificar la banda apropiada mediante un kit de extracción de gel comercial. </li></ol&gt; </li><li> Restricción NOTA: Para clonar inserto aguas arriba del promotor TK 22 el producto purificado de PCR y el vector (por ejemplo, TK-Luc) debe ser digerido con HindIII y BamHI. <ol><li> Preparar una mezcla de reacción de 50 l que contiene 1 g de producto purificado PCR, 1 HindIII mu l (20 U / l), 1 l BamHI (20 U / l) y 5 l de 10x tampón. </li><li> Preparar un vector que contiene 250 l mezcla de reacción 5μg (TK Luc, o vector indicador alternativo), 5 l HindIII (20 U / l), 5 l BamHI (20 U / l), 5 l termosensible fosfatasa alcalina (1 U / l) y 25 l de 10x tampón. NOTA: El tratamiento de la AP vector disminuye en gran medida la auto-ligación del vector digerido y por lo tanto solo el fondo. </li><li> Se incuban las mezclas de reacción durante 4 horas a 37 ° C, a continuación purificar los productos de la PCR digerido y el vector con un kit de purificación de PCR comercial. </li></ol></li><li> Ligationorte <ol><li> Configurar la reacción de ligación en tubos de PCR incluyendo 2 l de 10x T4 tampón ADN ligasa, 10 ng TK-Luc vector, inserto 50 ng (digerido producto de PCR), 1 l de ADN ligasa de T4 (400 U / l) y libre de nucleasa agua hasta 20 l. NOTA: Preparar un control negativo, donde la reacción no contiene inserto. </li><li> Mezclar suavemente la reacción de la pipeta hacia arriba y hacia abajo, centrifugar brevemente los tubos de PCR utilizando mini centrífuga y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Heat inactivar a 65 ° C durante 10 min y después se enfría en hielo y utilizar 5 l de producto para la transformación en 50 l de células competentes (por ejemplo, DH5a). </li><li> Use el procedimiento de choque térmico estándar para transformar bacterias, recoger colonias y aislar el ADN plásmido con un kit comercial. Validar todas las construcciones mediante la secuenciación antes de los pasos a seguir. </li></ol></li><li> La transfección de células madre embrionarias <ol><li> Utilice placas de 48 pocillos. Añadir 200 l solut gelatina 0,1%ion / pocillo 30 min antes de chapado celular. </li><li> madre embrionarias (ES) las células de la placa al día antes de la transfección. Utilizar células madre embrionarias libres de alimentador y placa a una densidad de 3 x 10 4 células por pocillo en 250 l ES medios / pocillo. </li><li> Preparar las mezclas de plásmidos (cada mezcla se calcula para 8 pocillos, 4 sin tratar y 4 tratado con ácido retinoico) Mezclar 1:. 1250 ng TK-Luc vacío (control negativo), 950 ng de β-galactosidasa vector de codificación (beta Gal), mezcla de 2 : 1.250 ng TK-Luc Hoxa1 potenciador (control positivo), 950 ng beta Gal, mezcla 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 potenciador (región de interés), 950 ng beta Gal. NOTA: células madre embrionarias expresan los factores de transcripción deseadas (RAR / RXR). Deja pozos no transfectadas para determinar los valores de base más tarde, durante las mediciones de luciferasa y β-galactosidasa. </li><li> Añadir medio de suero reducido de calidad transfección de cada plásmido mezclar hasta 106 l volumen total (suficiente para 8 pocillos). </li><li> Añadir 4,5 l transfectar calidad ESreactivo de iones luego mezclar cuidadosamente con la pipeta 15 veces arriba y abajo. Incubar la mezcla de transfección durante 10 min a RT. </li><li> Añadir 13 l de la mezcla de transfección a las células por pocillo, mezclar bien con la pipeta. Colocar las células de nuevo en la incubadora (37 ° C) O / N antes del tratamiento ligando. </li><li> Retire el medio cuidadosamente por aspiración de las células y añadir 250 l fresca media / pocillo que contiene 0,01 - 1 M ácido trans-retinoico (RA) como la concentración final o DMSO como vehículo. Se incuban las células por 24 - 48 h. Nota: El ácido retinoico es sensible a la luz. </li></ol></li><li> Preparación de lisados ​​de células <ol><li> Diluir 5x tampón de lisis (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 ditiotreitol M (DTT) (en H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml de glicerol, 5 ml de Triton X-100, estéril agua hasta 100 ml) en 1X usando agua estéril, añadir 20 l DTT 1 M / 10 ml y se equilibre a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar 10 ml para una placa de 48 pocillos en el día del ensayo. </li&gt; <li> Retire el medio cuidadosamente por aspiración de las células. Enjuagar las células una vez con PBS 1x. Añadir 200 l de 1x tampón de lisis / pocillo directamente a las células. </li><li> Agitar durante 2 horas a RT (lisis química). Congelar los lisados ​​de células en la placa a -80 ° C (lisis mecánica). Los lisados ​​se pueden almacenar a -80 ° C durante varios días. </li><li> Descongelar los lisados. Después de la descongelación completa, la transferencia de lisados ​​de células a una placa de 96 pocillos usando una pipeta multicanal electrónica. Transferencia de 80 l de lisado celular a placas de 96 pocillos clara para el ensayo de β-galactosidasa y 40 l de lisado celular a una placa blanca para la medición de la luciferasa. Evitar la formación de burbujas. </li></ol></li><li> β-galactosidasa de ensayo NOTA: beta galactosidasa o segundo reporteros alternativos deben utilizarse como un control interno para tener en cuenta las variaciones experimentales no específicos. <ol><li> Preparar tampón de sustrato β-galactosidasa: 80,0 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g de KCl, 1,0 g de MgSO 4 • 7H 2 O, realizar hasta 1.000 ml con agua estéril. Ajustar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración (0,2 micrómetros) y se almacena a 4 ° C </li><li> Mezclar tampón de sustrato 1 ml β-galactosidasa con 4 mg ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactosidasa). Añadir 3,5 l de 2-mercaptoetanol (βME) por 1 ml de tampón justo antes del uso. Añadir 100 l de tampón de sustrato de β-galactosidasa a 80 l de lisado celular. </li><li> Se incuban las reacciones a 37 ° C hasta que un color amarillo tenue se ha desarrollado. Leer la absorbancia a OD 420 nm en un lector de placas y exportación de datos. NOTA: El tiempo varía dependiendo de la eficiencia de la transfección, por lo general no más de 30 min. </li></ol></li><li> Ensayo de luciferasa <ol><li> Preparar 50 ml de reactivo sustrato luciferina: 15,1 mg de sal de D-luciferina, 82,7 mg de sal ATP, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, añadir a un tubo de 50 ml de polipropileno,a continuación, añadir 1,5 ml de tampón de HEPES 1 M, 48,5 ml de agua libre de ATP, vórtice, asegúrese de que todos los compuestos se disuelven completamente. Mantener 5 - 10 ml alícuotas a -80 ° C. </li><li> Caliente reactivo sustrato luciferina 5 ml a temperatura ambiente antes de comenzar. Pipetear 100 l de reactivo de sustrato a cada pocillo de la placa de blanco que contiene los 40 l de lisado celular y medir la señal inmediatamente usando una máquina de contador luminiscente. </li><li> Obtener actividades de al menos tres experimentos independientes en transfecciones por triplicado. </li><li> Calcular primero la actividad de la luciferasa normalizada base y los valores de β-galactosidasa normalizados de base para cada pocillo restando los valores medios medidos para las células no transfectadas de cada valor medido. A continuación, calcular la relación de la actividad de luciferasa / β-galactosidasa. </li></ol></li></ol> 3. Caracterización del ARN del reforzador NOTA: Un indicador más directo de la actividad potenciador ha surgido de reciente genoma-wide estudios que identificaron muchos ARNs no codificantes cortos, que varían en tamaño desde 50 a 2.000 nt, que se transcribe a partir de potenciadores, y se denominan ARN potenciador (16,25,26) Ernas (Figura 4). inducción erna altamente correlaciona con la inducción de genes de exones codificantes adyacentes. Por lo tanto, potenciador de la actividad dependiente de la señal se puede cuantificar in vivo mediante la comparación de la producción erna entre diversas condiciones de RT-qPCR. <ol><li> Directrices para la cartilla de diseño para la detección erna por RT-qPCR <ol><li> Seleccionar regiones genómicas para mediciones erna que son al menos 1,5 - de 2 kb lejos de los sitios de inicio de transcripción anotada. NOTA: Es importante destacar que los altos niveles de la transcripción del ARNm a través de potenciadores de intragenic prevenir la cuantificación exacta de erna en la orientación sentido, Ernas antisentido en potenciadores intragenic son detectables y son similares en el nivel de Ernas en potenciadores extragenic. </li><li> Como regla general, utilizar regiones 200 - 1000 pb from el centro del factor de transcripción sitio de interés para el diseño del cebador, ya sea en el sentido o hebra anti-sentido (Figura 4 y la Figura 6) de unión. NOTA: Si GRO-ss, ss-DNasa, H3K4me1, H3K4me3 o los datos H3K27ac chip-ss están disponibles a partir de los tipos de células deseados y las condiciones que se puede utilizar para el primer diseño más preciso. Ernas se transcriben a partir de regiones de potenciador putativo que se caracterizan por altos niveles de H3K4me1 y ME3. La expresión de Ernas se correlaciona positivamente con el enriquecimiento de la marca activada promotor de histona H3K27ac. </li><li> Cebadores de PCR para la medición Diseño RT-qPCR de Ernas basado en colorante fluorescente por Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generar secuencia anti-sentido (complemento de la cadena de sentido inverso) para el diseño de cebadores según: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. De inserción 200 - 300 pb de la secuencia con sentido o antisentido para el primer diseño. </li></ol></li><li> La medición de Erna Transcripción </strong&gt; <ol><li> Aislar el ARN total a partir de células tratadas con el reactivo de extracción con fenol ácido comercial / basados ​​en cloroformo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Utilice DNaseI para tratar ARN aislado antes de usarlos en la reacción de transcripción inversa. Inactivar la DNasa acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de la transcripción inversa. </li><li> Medir la concentración de ARN después del tratamiento con DNasa I y el uso de 1,000 ng por reacción de RT. Utilice la transcriptasa inversa de alta calidad. NOTA: Como gran número de Ernas puede no poliadenilado, transcripción inversa requiere el uso de cebadores aleatorios. </li><li> Detectar a transcripción inversa erna por RT-qPCR utilizando un procedimiento estándar. Medida de un ARNm no tratamiento dependiente de la normalización (por ejemplo, 36B4, Ppia, GAPDH, Actb). </li></ol></li></ol>

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<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los últimos años, los avances en la tecnología de secuenciación han permitido predicciones a gran escala de potenciadores en muchos tipos de células y tejidos 7-9. El flujo de trabajo descrito anteriormente permite realizar la caracterización primaria de los potenciadores candidatos elegidos en función de los datos de ChIP-seq. Los pasos y notas detallados ayudarán a cualquier persona a configurar una validación de potenciador de rutina en el laboratorio.
El paso más crítico en e...

El desarrollo de un organismo multicelular requiere una expresión regulada con precisión de miles de genes a través de los tejidos en desarrollo. La regulación de la expresión génica se lleva a cabo en gran parte gracias a los potenciadores. Los potenciadores son elementos cortos de ADN no codificantes que pueden unirse a factores de transcripción (TF) y actuar a distancia para activar la transcripción deun gen diana. Los potenciadores son generalmente de acción cis y se encuentran con mayor frecuencia justo aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS), pero estudios recientes también describieron ejemplos en los que los potenciadores se encontraron mucho más arriba, en los 3' del gen o incluso dentro de los intrones y exones2. 
Hay cientos de miles de potenciadores potenciales en los genomas de los vertebrados1. Los métodos recientes basados en la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) proporcionan datos de alto rendimiento de todo el genoma que se pueden utilizar para el análisis de potenciadores3-9. Aunque los datos obtenidos por los experimentos ChIP-seq aumentan en gran medida la probabilidad de identificar potenciadores específicos de células y tejidos, es importante tener en cuenta que los sitios de unión detectados no necesariamente identifican la unión directa al ADN y/o los potenciadores funcionales. Por lo tanto, es indispensable un análisis funcional adicional de los potenciadores recientemente identificados. En este trabajo, presentamos un proceso básico de tres pasos para la identificación y validación de potenciadores activos putativos. Esto incluye: 1) selección de sitios de unión de factores de transcripción putativos mediante análisis bioinformático de datos ChIP-seq, 2) clonación y validación de estas secuencias reguladoras en construcciones reporteras, y 3) medición de ARN potenciador (eRNA). 
La exposición de las células madre embrionarias (ES) al ácido retinoico (AR) se utiliza con frecuencia para promover la diferenciación neuronal de las células pluripotentes 10. La artritis reumatoide ejerce sus efectos uniéndose a los receptores de artritis reumatoide (RARα, β, γ) y a los receptores de retinoides X (RXRα, β, γ). Los RAR y RXRs en forma de heterodímero se unen a motivos de ADN llamados elementos de respuesta RA, que normalmente se disponen como repeticiones directas de la secuencia AGGTCA (llamada medio sitio) y regulan la transcripción. Los experimentos de tratamiento con ligandos permitieron la identificación de varios genes regulados por ácido retinoico en células madre embrionarias 11,12. Sin embargo, aún no se han descrito elementos potenciadores para muchos de estos genes. Para demostrar cómo se puede utilizar el flujo de trabajo descrito aquí para la identificación y validación de potenciadores, mostramos paso a paso la selección y caracterización de dos potenciadores dependientes del ácido retinoico en células madre embrionarias.

<table><tbody><tr><td>KOD ADN polimerasa</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>para la amplificación por PCR de un potenciador a partir de ADNg</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>para el aislamiento genómico de ADN</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>para la purificación de productos PCR</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>para la extracción de gel si hay más productos de PCR</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>enzima de restricción</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>enzima de restricción</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>liberación de grupos fosfato 5' y 3' del ADN</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>para ligadura</td></tr><tr><td>QIAprep Kit Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>para el aislamiento de plásmidos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES</td></tr><tr><td>media MEM Aminoácido no esencial</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES</td></tr><tr><td>media Beta Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES</td></tr><tr><td>medios FuGENE HD&nbsp;</td><td>Reactivo de transfección</td> <td>Promega</td><td>E2311</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>para la transfección</td></tr><tr><td>Ácido retinoico totalmente trans</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligando, para la activación de RAR/RXR</td></tr><tr><td>Placa transparente de 96 pocillos</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>Placa blanca de 96 pocillos</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>para el ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>D-luciferina, sal de potasio</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>para ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>Sal de ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>para ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>para el ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>para el ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta;-D-galactosidasa)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>para el ensayo de beta galactosidasa</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026 Aislamiento de</td><td>ARN</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>transcripción inversa de ARNe</td></tr><tr><td>Dnase libre de ARNe,</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Tratamiento de adnasa</td></tr>, <tr><td>SsoFast, Eva Green</td>, <td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Máquina de qPCR</td><td>BioRad</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas BioTek Synergy 4</td><td>Contador luminiscente</td> <td>BioTek</td><td></td></tr></tbody></table>

predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

El desarrollo embrionario es un proceso de múltiples etapas que implica la activación y la represión de muchos genes. Los elementos potenciadores en el genoma se sabe que contribuyen a los tejidos y células de tipo regulación específica de la expresión génica durante la diferenciación celular. Por lo tanto, su identificación y de la investigación es importante para entender cómo se determina el destino celular. La integración de los datos de expresión de genes (por ejemplo, microarrays o RNA-seq) y los resultados de la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), con base en los estudios de genoma completo (chip-ss) permite la identificación a gran escala de estas regiones reguladoras. Sin embargo, la validación funcional de potenciadores específicas del tipo de célula requiere más in vitro y en los procedimientos experimentales in vivo. A continuación se describe cómo se pueden identificar y validar experimentalmente potenciadores activos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo paso a paso que incluye: 1) la identificación de regiones reguladoras por análisis, 2) la clonación y exper datos chip-ssvalidación imental del potencial regulador putativo de las secuencias genómicas identificadas en un ensayo reportero, y 3) la determinación de potenciador de la actividad in vivo mediante la medición de nivel de transcrito de ARN potenciador. El protocolo que se presenta es suficientemente detallada para ayudar a cualquier persona para establecer este flujo de trabajo en el laboratorio. Es importante destacar que, el protocolo puede ser adaptado fácilmente y utilizado en cualquier sistema de modelo celular.

Se utilizó un anticuerpo específico para RXR-pan con el fin de identificar los genes que RA-regulada en todo el genoma tienen enriquecimiento receptor en su proximidad. Bioinformática análisis de los datos de RXR chip-ss obtenidas a partir de células madre embrionarias tratados con ácido retinoico reveló el enriquecimiento de la mitad sitio receptor nuclear (AGGTCA) bajo el RXR ocupado sitios (Figura 1). El uso de un algoritmo de bioinformática hemos mapeado vuelta el re...

En este trabajo proporcionamos un flujo de trabajo experimental de cómo se pueden identificar y validar experimentalmente los potenciadores activos.

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

El objetivo general de este video es proporcionar un conjunto integrado de métodos para identificar y validar experimentalmente elementos reguladores genómicos, denominados potenciadores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la transcripción y regulación de eventos biológicos, incluyendo la selección y utilización de potenciadores, durante la diferenciación celular o en respuesta a estímulos externos. La principal ventaja del flujo de trabajo presentado es que el protocolo puede adaptarse y utilizarse fácilmente en cualquier sistema de modelos celulares.Mostraré los pasos del procedimiento. Para comenzar, seleccione un potenciador candidato basado en un análisis previo de secuenciación por inmunoprecipitación de cromatina (chip seq). Utilice un navegador genómico para ver los resultados del experimento de chip seq deseado e identifique sitios de unión en la proximidad del gen de interés.Seleccione Definir una Región de Interés para obtener una secuencia de 200-400 pares de bases de la región genómica seleccionada, y utilice las secuencias para el diseño posterior de cebadores. Con técnicas estándar de biología molecular, amplifique y clone la región genómica seleccionada en un vector de plásmido reportero. Para probar la actividad del potenciador, transfecte los constructos reporteros en células madre embrionarias masivas agregando primero 200 micro litros de solución de gelatina al 0,1 % por pocillo a placas de 48 pocillos.Incube las placas durante 30 minutos antes de sembrarlas. El día anterior a la transfección, siembre células madre embrionarias libres de células alimentadoras, o células EM, en 250 microlitros de medio EM a una densidad de tres veces 10 a la cuarta células por pocillo. El día de la transfección, prepare las mezclas de plásmidos, haciendo suficiente cantidad para ocho pocillos a partir de cada mezcla.Añada medio con suero reducido de calidad para transfección a cada mezcla de plásmidos para llevar el volumen hasta 106 micro litros. Luego, añada 4,5 micro litros de reactivo de transfección de calidad ES y mezcle cuidadosamente pipeteando 15 veces hacia arriba y hacia abajo. Incube la mezcla de transfección durante 15 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, agregue 13 micro litros por pocillo de la mezcla de transfección a las células y mezcle bien mediante pipeteo. Luego, coloque las células de regreso en el incubador durante la noche antes del tratamiento con líquen. La eficiencia de transfección es un paso crítico.Si se utiliza otro tipo celular, este paso requiere una optimización. Utilice el tipo celular más relevante para probar la actividad del potenciador con el fin de minimizar los efectos dependientes del contexto. Al día siguiente, retire cuidadosamente el medio mediante aspiración y agregue 250 micro litros de medio fresco por pocillo que contenga un micro molar de ácido retinoico todo trans o DMSO como vehículo.Incube las células durante 24-48 horas. Después de preparar el tampón de lisis según el protocolo descrito, aspire cuidadosamente el medio de las células. Use PBS 1X para lavar las células una vez, luego agregue 200 µL de tampón de lisis 1X por pocillo.Agite las células a temperatura ambiente durante dos horas. Luego, para lograr la lisis celular completa, congele los lisados celulares en la placa a 80 grados Celsius. Después de descongelar completamente los lisados, use una pipeta electrónica multicanal para transferir 80 µL del lisado celular a una placa transparente de 96 pocillos para la beta-galactosidasa, y 40 µL del lisado a una placa blanca para la medición de luciferasa.Para realizar la beta galactosidasa, mezcle un mililitro del tampón sustrato beta gal con cuatro miligramos de OMPG. Luego, añada 3,5 micro litros de beta mercaptoetanol a la mezcla y agregue inmediatamente 100 micro litros del tampón a 80 micro litros del lisado celular. Incube las reacciones a 37 grados Celsius hasta que se desarrolle un color amarillo tenue.Lea la absorbancia a 420 nanómetros en un lector de placas y exporte los datos. Para realizar el ensayo de luciferasa, después de preparar el reactivo sustrato según el protocolo descrito, caliente el reactivo sustrato de luciferasa a temperatura ambiente antes de comenzar. Luego, pipete 100 microlitros en cada pocillo de la placa blanca que contiene los 40 microlitros de lisado celular.Utilice inmediatamente una máquina contador de luminiscencia para medir la señal. Obtenga las actividades a partir de al menos tres transfecciones y experimentos independientes. Realice los cálculos para ambos ensayos según el protocolo descrito en el texto.Para diseñar los cebadores para la detección de ARNe mediante RT-PCR, seleccione una región genómica que se encuentre al menos a 1,5-2 kilobases de distancia de cualquier transcrito génico anotado. Identifique la dirección relativa del gen y determine la posición de los transcritos sentido y antisentido. Para diseñar cebadores para la cuantificación de ARN del potenciador, elija regiones situadas entre 200 y 1.000 pares de bases del centro del sitio de unión del factor de transcripción.Si el gen se encuentra en la hebra negativa, copie entre 200 y 300 pares de bases de la hebra positiva y convierta la secuencia para obtener la secuencia complementaria inversa. Luego, utilice esta secuencia para el diseño posterior de cebadores. Establezca el rango de tamaño del producto entre 80 y 150 pares de bases.Para medir la transcripción de ARNe, tras aislar el ARN total de células tratadas según el protocolo descrito en el texto, detecte el ARNe transcrito a reversa mediante RT-PCR utilizando un procedimiento estándar. Mida un ARNm independiente del tratamiento para la normalización. Como se muestra aquí, el análisis bioinformático de datos de secuenciación de cromatina inmunoprecipitada (ChIP-seq) de RXR obtenidos de células ES tratadas con ácido retinoico reveló el enriquecimiento del sitio medio del receptor nuclear en las regiones ocupadas por RXR.Mediante un algoritmo de bioinformática, los resultados de la búsqueda de motivos para el sitio medio fueron mapeados nuevamente sobre los datos de secuenciación de cromatina (chip seq) de RXR. Este análisis identificó picos de chip que coincidían con sitios de unión canónicos de receptores nucleares. La visualización de los sitios en IGV indicó un enriquecimiento de los factores de transcripción cercanos a Hoxa1.Un objetivo previamente caracterizado de RAR RXR. También se identificó un potenciador novedoso para una nueva cadena objetivo de RA, PRMT8. Las regiones potenciadoras identificadas se clonaron en un vector reportero de luciferasa TK, y las células ES se transfectaron con estos constructos.La actividad de la luciferasa se midió en ausencia y en presencia de RA. Los constructos que contenían el elemento de respuesta a RA, o RARE, mostraron un aumento en la intensidad de la señal de luciferasa tras el tratamiento con RA, mientras que el constructo sin el RARE no fue inducido. Para determinar si la expresión de eRNA en sentido y antisentido del potenciador unido a RAR RXR del Hoxa1 se correlaciona con la expresión de ARNm del gen, también se midió el nivel de eRNA de Hoxa1. Los resultados confirmaron que la actividad del potenciador es inducida por un tratamiento breve con RA.Una vez dominado, esta carga de trabajo puede realizarse en pocos días llevando a cabo el experimento de atrapamiento de potenciadores descrito y la cuantificación de potenciadores, permitiendo así obtener evidencia funcional sólida de la actividad de un potenciador. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar y caracterizar potenciadores punitivos. Una vez que se ha identificado y validado un potenciador, se pueden realizar otros métodos, como la captura de conformación cromosómica, o CCC, con el fin de responder preguntas adicionales importantes, como ¿qué gen es regulado por el potenciador validado?

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

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Diferenciación de células corporales embrioides en progenitores neurales mediante ácido retinoico

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad del ácido retinoico en embriones de ratón. Al aislar las células de los embriones de ratón, las células se cocultivan con células reporteras de ácido retinoico (AR). Las células embrionarias producen AR, que induce la expresión de beta-galactosidasa en las células reporteras, lo que indica actividad de AR en las células embrionarias.

Empleo de células reporteras en un cocultivo para estudiar la producción de ácido retinoico por células embrionarias de ratón

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

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La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

A continuación, se describe un método para la purificación de células madre embrionarias humanas diferenciadas que están comprometidas hacia el endodermo definitivo para la mejora de las aplicaciones posteriores y otras diferenciaciones.

Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

No existen métodos para medir con precisión los niveles de ácido retinoico (AR) en pequeñas cantidades de tejido. Este protocolo describe la medición sencilla y cuantitativa de los niveles relativos de AR en embriones E8.5 y neuroesferas utilizando una línea celular reportera de AR.

La medición cuantitativa de los niveles relativos de ácido retinoico en E8.5 embriones y Neurosphere culturas utilizando el ensayo indicador basado en células raras-lacZ F9

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

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Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.

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Aprende a identificar y validar elementos reguladores genómicos llamados potenciadores mediante análisis ChIP-seq y ensayos de luciferasa en células madre embrionarias. Este protocolo adaptable permite estudiar la regulación transcripcional durante la diferenciación celular.

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

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