Name: Imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprende a cuantificar la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento usando microscopía confocal y de campo amplio. Este método estandarizado permite analizar cambios estructurales en diferentes tejidos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análisis de la morfología mitocondrial en C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>para la inhibición de la proliferación</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Microscopio confocal&nbsp;</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>disolvente para medicamentos</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio HistoBond</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>para la preparación de portaobjetos</td></tr><tr><td>LB Caldo VWR</td><td></td><td>95020-778</td><td>para LB</td></tr><tr><td>LEICA S7E Osciloscopio de disección</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Microscopio de disección estándar</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>158101100 LEICA THUNDER</td><td>Microscopio compuesto</td><td>Leica</td><td>11525679</td></tr><tr><td>sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>pL4440 plásmido de vector vacío plásmido</td><td>addgene</td><td>#1654</td><td>para plásmido de vector vacío</td></tr><tr><td>cloruro de potasio</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>para lejía soluton</td></tr><tr><td>Potasio fosfato dibásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>para</td></tr><tr><td>M9 Azida sódica</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>para gusanos paralizantes</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>para solución</td></tr> <tr><td>de lejíaFosfato de sodio dibásico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>para</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td> M9 <td>VWR</td><td>97061-638</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>WOB-L&not; &AElig; Bombas de vacío en seco, de servicio estándar, Welch&not; &AElig;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>para aspiración</td></tr></tbody></table>

imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en c. elegans durante el envejecimiento

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans es un gran modelo para la obtención de imágenes mitocondriales debido a su cuerpo transparente, que permite obtener fácilmente imágenes de animales vivos y gusanos enteros sin una preparación excesiva de la muestra. Además, la morfología mitocondrial en diferentes tejidos se puede visualizar fácilmente mediante el uso de promotores específicos de tejido para expresar proteínas fluorescentes dirigidas a las mitocondrias. Aquí, se utilizaron myo-3p (para las mitocondrias musculares), vha-6p (para las mitocondrias intestinales) y col-19p (para las mitocondrias hipodérmicas) para impulsar la expresión de una GFP (secuencia de localización mitocondrial de la proteína ATP-1) dirigida a las mitocondrias. Las mitocondrias de los músculos de la pared corporal de C. elegans exhiben una morfología tubular, alineándose a lo largo de las fibras musculares (miofibrillas) (Figura 1A); las mitocondrias intestinales mostraron estructuras altamente interconectadas, en forma de telaraña, con una alineación menos uniforme (Figura 1B); y la hipodermis tiene mitocondrias tubulares que parecen más redondeadas u ovaladas en comparación con el intestino o el músculo (Figura 1C). La morfología mitocondrial es generalmente consistente a lo largo del gusano en el músculo y el intestino, pero la hipodermis muestra algunas diferencias menores en la interconexión de las mitocondrias entre los extremos proximal y distal del gusano. Por lo tanto, para lograr resultados experimentales reproducibles, se recomienda centrarse en una región específica de sus cuerpos. Aquí, el área entre la faringe y la vulva ~ 100-200 μm por debajo de la faringe se muestra consistentemente.
En el caso de las mitocondrias musculares e hipodérmicas, la obtención de imágenes bajo un microscopio compuesto proporciona una resolución suficiente debido a la planitud de las células y a los bajos niveles de luz desenfocada. Sin embargo, las mitocondrias intestinales son difíciles de observar con un microscopio compuesto, ya que el gran volumen del intestino limita la resolución debido a la gran cantidad de luz desenfocada de otras secciones del intestino (Figura 2). Por lo tanto, se recomienda obtener imágenes de las mitocondrias intestinales bajo un microscopio confocal para reducir la luz desenfocada y visualizar la morfología mitocondrial adecuada.
La forma de las mitocondrias es muy dinámica y cambia en función del entorno metabólico de los animales23 o incluso debido a la exposición a rigideces variables del sustrato24. Por lo tanto, dejar a los animales en portaobjetos de microscopio durante largos períodos de tiempo en ausencia de una fuente de alimento y sobre el sustrato rígido del vidrio puede afectar potencialmente la morfología mitocondrial. Aquí, este estudio encontró que las mitocondrias de los gusanos se fragmentan después de aproximadamente 30 minutos en un portaobjetos en solución M9, siendo las mitocondrias hipodérmicas las que muestran la mayor fragmentación (Figura 3). Por lo tanto, las imágenes de las mitocondrias deben realizarse rápidamente después de la preparación de la muestra.
Los productos químicos que restringen la movilidad de los gusanos, como la azida de sodio y la tetramisola, se utilizan comúnmente para obtener imágenes en vivo de C. elegans, ya que se requieren gusanos estacionarios para capturar múltiples secciones z de animales para obtener imágenes en 3D. Estudios previos han demostrado que la exposición a la azida sódica o tetramisol puede resultar en la fragmentación mitocondrial25. Sorprendentemente, se encontró que la azida de sodio, incluso en altas concentraciones, tenía un impacto limitado en la morfología mitocondrial en el músculo o el intestino. Sin embargo, la hipodermis mostró una fragmentación mitocondrial más temprana que los controles M9 (Figura 3). Es importante destacar que las altas concentraciones de tetramisol (100 mM) dieron lugar a una fragmentación mitocondrial significativa inmediatamente después de la exposición en todos los tipos de células. En comparación, las concentraciones medias (10 mM) resultaron en una fragmentación más rápida en comparación con un control M9. Las bajas concentraciones (1 mM) tuvieron un impacto limitado en la morfología mitocondrial. Estos datos sugieren que la utilización de azida sódica puede ser una opción viable para la obtención rápida de imágenes de las mitocondrias, mientras que el tetramisol debe evitarse en general.
Como se esperaba, las mitocondrias de todos los tejidos de C. elegans muestran fragmentación durante el proceso natural de envejecimiento (Figura 4A). La fragmentación se puede visualizar como mitocondrias que se presentan como estructuras más truncadas y esféricas, que son dramáticamente diferentes de las mitocondrias lineales y tubulares que se muestran en animales jóvenes. Es importante tener en cuenta que el intestino aumenta en estructuras esféricas autofluorescentes a una edad más avanzada, por lo que se debe tener cuidado de no confundir la autofluorescencia con las estructuras mitocondriales reales. Debido a que puede haber variabilidad de cambios en la estructura mitocondrial entre los gusanos, es importante realizar la cuantificación de la morfología mitocondrial en un tamaño de muestra significativo en lugar de solo obtener imágenes de unos pocos gusanos. En este caso, se utilizó mitoMAPR, que permite la cuantificación automatizada de la morfología mitocondrial utilizando un conjunto diverso de métricas, incluidos objetos, redes, uniones por red, puntos de unión, longitud del objeto, huella mitocondrial, cobertura mitocondrial y área del objeto (Tabla Suplementaria 1 y Tabla Suplementaria 2). La automatización elimina el sesgo subjetivo del usuario. Aquí, informamos que la métrica de longitud del objeto es óptima para medir cuantitativamente los cambios en la morfología mitocondrial muscular e intestinal durante el envejecimiento, y las métricas de puntos de unión para medir los cambios en la morfología mitocondrial hipodérmica durante el envejecimiento (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Figura 1: Imágenes de las mitocondrias en todo el cuerpo de C. elegans. Se realizaron imágenes mitocondriales durante todo el día 5 en animales adultos cultivados con EV desde la etapa L1 en animales transgénicos con expresión de MLS::GFP en el músculo (A), el intestino (B) y la hipodermis (C). Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Figura 2: Comparación de las imágenes mitocondriales entre el microscopio compuesto y el microscopio confocal. Las imágenes mitocondriales se realizaron en animales adultos de día 1 cultivados en EV desde la etapa L1 en animales transgénicos con expresión de MLS::GFP en el músculo (A), el intestino (B) y la hipodermis (C). Barra de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Figura 3: Valoración de la fragmentación mitocondrial de diferentes tejidos tras el tratamiento con M9, azida sódica y tetramisole. Las imágenes mitocondriales se realizaron en animales adultos de día 1 con expresión de MLS::GFP en el músculo, el intestino y la hipodermis. Los animales se cultivaron en EV desde la etapa L1. Los animales se colocaron en portaobjetos que contenían M9, azida sódica (1 mM, 10 mM y 100 mM) o tetramisol (1 mM, 10 mM y 100 mM) y las imágenes se realizaron inmediatamente después de la preparación del portaobjetos (0 min) o 15 min o 30 min después de la preparación del portaobjetos. Se muestran imágenes representativas para n &gt; 5 animales por cepa para 2 réplicas biológicas. Barras de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Figura 4: Imágenes mitocondriales de C. elegans durante el envejecimiento en diferentes tejidos y cuantificación de la morfología mitocondrial mediante MitoMAPR. (A) Se realizaron imágenes mitocondriales en animales adultos en los días 1, 5, 9, 13 y 15 de la edad adulta con expresión de MLS::GFP en el músculo, el intestino y la hipodermis. Los animales se cultivaron en EV desde la etapa L1 y se trasladaron a placas EV que contenían FUDR desde la etapa adulta del día 1. Las imágenes son representativas de n ≥ 5 animales por cepa para ≥ 3 réplicas biológicas. Barra de escala: 5 μm. (B) La cuantificación de la longitud del objeto de las mitocondrias musculares y las mitocondrias intestinales de los gusanos en los días 1, 5, 9, 13 y 15, y la cuantificación de los puntos de unión de las mitocondrias hipodérmicas de los gusanos en los días 1, 5, 9, 13 y 15. Todos los puntos de datos individuales combinados con la media ± DE. Los gráficos se trazaron y analizaron estadísticamente mediante una prueba t de Student. ns = no significativo, *p &lt; 0,03; **p &lt; 0,002; p &lt; 0,0002; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Días de lombrices</td>
			<td>Número de gusanos</td>
			<td>Volumen de tampón (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Números recomendados de gusanos y volúmenes de tampón al preparar portaobjetos.
Figura complementaria 1: Flujos de trabajo de la aplicación de una cuantificación de una sola imagen utilizando MitoMAPR y procesamiento por lotes para múltiples imágenes. (A) Flujo de trabajo de cuantificación de la morfología mitocondrial a partir de una sola imagen utilizando la macro MitoMAPR. (B) Proyección Z de un archivo de imagen 3D sin procesar usando Fiji (proyección máxima). (C) Recortar la región de interés de la imagen proyectada Z. (D) Imágenes de Skeletor adquiridas de la macro MitoMAPR. Barras de escala: 5 μm. (E) Flujo de trabajo de cuantificación de la morfología mitocondrial a partir de múltiples imágenes utilizando un proceso por lotes utilizando la macro MitoMAPR. (F) Captura de pantalla de la macro de recorte. (G) Captura de pantalla de un proceso por lotes para la proyección Z. (H) Captura de pantalla de la ventana de confirmación de selección de la macro de recorte por lotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 1: Análisis cuantitativo de las métricas de morfología mitocondrial en tejido muscular de C. elegans . Las métricas registradas incluyen objetos, redes, cruces por red, puntos de unión, longitud del objeto, huella mitocondrial, área del objeto y cobertura mitocondrial, medidos a lo largo de diferentes días. Los datos proporcionan una base para evaluar los cambios en la morfología mitocondrial con el envejecimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 2: Efectos de los productos químicos inmovilizadores sobre la morfología mitocondrial en C. elegans. Los datos incluyen mediciones como objetos, redes, uniones por red, puntos de unión, longitud del objeto, huella mitocondrial, área del objeto y cobertura mitocondrial en diferentes concentraciones y puntos de tiempo después de la preparación de la muestra con tampón M9 o diferentes concentraciones de tetramisol y azida de sodio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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Investigación

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Biología

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Aprende a cuantificar la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento usando microscopía confocal y de campo amplio. Este método estandarizado permite analizar cambios estructurales en diferentes tejidos.

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