Determinación de la morfología mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal

Nuestra investigación se centra en la neurofarmacología básica. Específicamente, estudiamos cómo funcionan las moléculas de los medicamentos. Nuestro objetivo es comprender la relación entre los posibles compuestos farmacológicos y la función mitocondrial en la enfermedad de Parkinson.

Estudios anteriores revisan los desafíos de análisis de células de laboratorio de larga data incluso con las pautas del fabricante. Para resolver esto, describimos un protocolo detallado paso a paso para evaluar la morfología mitocondrial en células de laboratorio. Nuestro protocolo utiliza una tinción mitocondrial simple, imágenes de fluorescencia y software de código abierto.

Esto reduce los costos, aumenta la accesibilidad y hace que sea más fácil de usar que alternativas complejas como la microscopía electrónica. Para comenzar, obtenga cultivos de células SH-SY5Y cultivadas en matraces que contienen DMEM / F12, suplementados con 10% de FBS. Desprender las células durante un minuto con una solución de tripsina al 0,05%.

A continuación, centrifugar las células a 100 g durante tres minutos antes de pasar. A continuación, suspenda las células SH-SY5Y en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 1%. Luego siembre las células en platos confocales con fondos de vidrio y manténgalos durante la noche.

Para la estimulación MPP+, reemplace el medio de cultivo con medio fresco con o sin 1-metil-4-fenilpiridinio durante 24 horas. Para la tinción de MitoTracker, diluya la solución madre de MitoTracker con medio DMEM/F12 precalentado para obtener una concentración de trabajo de 50 nanomolares. Mantenga la solución de tinción protegida de la luz durante todo el procedimiento.

Retire el medio de cultivo de las placas confocales. Lave las celdas dos veces con DMEM / F12 fresco. A continuación, pipetee un mililitro de la solución de trabajo MitoTracker en el plato.

Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Ahora retire la solución de trabajo MitoTracker y lave los platos dos veces con DMEM / F12. Después del último lavado, agregue un mililitro de DMEM / F12 a cada plato.

Incubar en la incubadora de células antes de la obtención de imágenes. Para preequilibrar el microscopio confocal para la obtención de imágenes, debajo del panel de adquisición, ajuste los parámetros de la trayectoria de la luz configurando las longitudes de onda de excitación y emisión. Establezca el tamaño estenopeico en 1.2 unidades aéreas, el tamaño de escaneo de píxeles en 1024 por 1024, el tiempo de permanencia de píxeles en 2.4 microsegundos con un promedio de dos.

Ahora use la luz halógena para enfocar las células usando una lente de objetivo apocromática plana de 60X con una apertura numérica de 1.4, minimizando la fototoxicidad. Ajuste la potencia del láser y el alto voltaje justo por debajo del nivel de saturación. Luego establezca el factor de zoom en tres y capture las imágenes.

Mueva la región de interés para enfocar otras células bajo el microscopio. Luego capture imágenes sin cambiar ninguna configuración. Para mejorar la calidad de la imagen antes de la transformación binaria y la esqueletización, primero abra la imagen.

Seleccione un área de una sola celda con la herramienta ROI. Ahora, haga clic secuencialmente en proceso, filtros, función de máscara de enfoque para mejorar la nitidez. Luego use el proceso y mejore el contraste para reducir la amplificación del ruido.

Haga clic en proceso, filtros y la opción mediana para eliminar el ruido de sal y pimienta. Para convertir la imagen a binario, haga clic en proceso seguido de binario y elija la opción crear binario. Esqueletizar la imagen binaria haciendo clic en proceso, binario y esqueletizar.

A continuación, agrupe todos los píxeles del esqueleto seleccionando analizar, seguido de esqueleto y analizar la función 2D 3D del esqueleto. Simplifique el análisis utilizando la herramienta MiNA para calcular nueve parámetros descriptivos en la imagen esqueletizada. La intensidad de fluorescencia de la tinción mitocondrial aumentó progresivamente con la concentración de CMXRos rojo MitoTracker de 25 nanomolares a 200 nanomolares.

Pero a los 200 nanomolares, se observó una tinción de fondo citoplasmático sustancial. La morfología mitocondrial se conservó mejor en medio DMEM/F12 en comparación con PBS una hora después de la tinción, aunque DMEM/F12 también mostró una mayor fluorescencia de fondo. El promedio de doble trama mejoró significativamente la relación señal/ruido en las imágenes mitocondriales en comparación con el modo de escaneo único.

Y el aumento del tiempo de permanencia de píxeles de 2,4 a 10,8 microsegundos dio como resultado imágenes más brillantes, pero causó fotoblanqueo. El aumento del alto voltaje intensificó el ruido de fondo, mientras que el aumento de la potencia del láser condujo al fotoblanqueo. La herramienta MiNA produjo resultados de esqueletización consistentes para imágenes tenues y brillantes, lo que indica una segmentación robusta a través de diferentes intensidades de fluorescencia, con la imagen brillante exhibiendo una intensidad 5,5 veces mayor que la imagen tenue.

El tratamiento con MPP+ a 500 micromolares alteró la morfología mitocondrial en las células SH-SY5Y en comparación con el control no tratado, lo que resultó en una huella mitocondrial significativamente reducida.