Comprensión de los cambios en la morfología mitocondrial a través de micrografías de fluorescencia dinámicas y tridimensionales

El objetivo de nuestra investigación es observar los cambios en las redes mitocondriales e investigar cómo cambian estas redes mitocondriales en respuesta a las condiciones celulares. Utilizamos herramientas de código abierto como Fiji y Python, combinando bibliotecas existentes con macros y scripts personalizados para automatizar el análisis de la morfología mitocondrial a partir de datos complejos de microscopía de fluorescencia. Lograr datos cuantitativos confiables y métricas que describan la dinámica de la fisión y fusión mitocondrial con su localización en 3D sigue siendo un desafío.

La estandarización para dicha generación de datos no está comúnmente disponible. Por lo tanto, existe un conocimiento limitado sobre la frecuencia de fisión y fusión específica de la célula y la localización intracelular. Agregamos la detección de vida de fisión y fusión mitocondrial a las métricas de investigación disponibles.

Y al combinarlos con el recuento de estructuras mitocondriales, pudimos definir una nueva métrica para comprender la dinámica de la red mitocondrial. Nuestros hallazgos nos permiten caracterizar parámetros de fisión y fusión específicos de la célula y, por primera vez, determinar si el sistema mitocondrial está en equilibrio o en movimiento. Esto evita una mala interpretación importante de los fenotipos en la salud y la enfermedad y proporciona un marco claro para informes precisos.

Para comenzar, abra el archivo sin procesar en ImageJ. Ajuste la configuración de color para mejorar la visibilidad de la región de interés, pero no establezca nada. Duplique la imagen de acuerdo con la cantidad de celdas individuales que deben analizarse.

Si hay varias celdas presentes en un campo de visión, vaya a Analizar, Herramientas y utilice la herramienta Ventanas sincronizadas y la herramienta Dibujo a mano alzada para dibujar una región de interés alrededor de una celda de interés y, a continuación, seleccione Editar y elija Borrar exterior para aislar la celda seleccionada. Divida los canales rojo y azul entre sí y guarde el canal mitocondrial como un archivo tif. Para generar una función de dispersión de puntos o PSF, vuelva a abrir la imagen sin procesar.

Luego abra el complemento del generador PSF seleccionando Complementos, luego eligiendo Generador PSF y seleccionando el Modelo óptico 3D de lobo nacido. Para abrir la información de la imagen RAW, seleccione Imagen y, a continuación, elija Mostrar información o pulse I en el teclado. Desplácese hasta la parte inferior de la ventana de información de la imagen.

Seleccione la opción de tamaño y profundidad del vóxel y cambie la longitud de onda a 568 nanómetros. Establezca el tamaño de píxel XY en 166,1 nanómetros, el paso Z en 200 nanómetros. Establezca el tamaño XYZ para que coincida con una resolución de imagen de 512 x 512 y configure la pila Z para que contenga 10 cortes Z.

Haga clic en Ejecutar. Guarde el PSF como un archivo tif en su propia carpeta. Vaya a Complementos, seleccione Macros y, a continuación, elija Editar, seguido de Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm para acceder a la macro de deconvolución. Edite las líneas de entrada y salida según sea necesario y presione Ejecutar para ejecutar la macro. Para mejorar el contraste de la imagen y el desenfoque, vaya a Complementos, seleccione Macros, elija Editar y abra Preprocesamiento.

ijm para acceder a la macro de preprocesamiento. Realice una resta de fondo estableciendo el radio de la bola rodante en 6. Establezca el Filtro Sigma Plus de modo que el radio se establezca en 1 vez el factor de escala.

El número de píxeles utilizados es 2 y la fracción mínima de píxeles es 0,2, lo que garantiza que el plugin esté configurado para tener en cuenta los valores atípicos. Ajuste la configuración de CLAHE configurando el tamaño de bloque en 64, los intervalos de histograma en 256, la pendiente máxima en 2,5 y gamma en 0,8 y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Abra un archivo de interés que se haya modificado mediante el proceso previo.

ijm macros en ImageJ. Vaya a Complementos y seleccione Umbral adaptable. Establezca el umbral local en la media ponderada y ajuste el tamaño del bloque de píxeles según sea necesario.

Haga clic en Vista previa y ajuste el tamaño del bloque para incluir claramente tantas mitocondrias como sea posible. Modifique el valor de resta de cada celda para eliminar el fondo innecesario y tome nota de la micrografía resultante. Para optimizar el tiempo, ordene las imágenes en archivos según el valor de resta aplicado.

Ahora navegue a Complementos, seleccione Macros, elija Editar y abra Umbral. ijm para acceder a la macro de umbral. Edite el script de macro para definir las rutas de entrada y salida correctas, el tamaño de bloque y los valores de sustracción.

Haga clic en Ejecutar para ejecutar la macro. Abra hasta 10 micrografías con umbral que pertenezcan a la misma condición de tratamiento. Vaya a Imagen, Pilas, Herramientas y seleccione Concatenar, luego presione OK.To eliminar los pequeños puntos residuales que dejan los umbrales, vaya a Complementos, seguido de Filtros de imagen integrales y luego seleccione Eliminar valores atípicos.

Utilice la vista previa para ajustar los tamaños X e Y para eliminar fragmentos. Guarde el archivo concatenado como un archivo TIF. Finalmente, navegue a Complementos, Macros, Editar, QuickTest_new.ijm.

Edite las líneas de ruta de entrada y salida para que apunten a los directorios adecuados, haga clic en Ejecutar y visualice los resultados del localizador de eventos mitocondriales o MEL. La dinámica mitocondrial se rastreó a lo largo del tiempo con puntos rojos que marcan eventos de fisión y puntos verdes que marcan eventos de fusión en vistas 3D y 2D. Las redes mitocondriales mostraron diferencias específicas del tratamiento en la estructura a lo largo del tiempo con formas más alargadas e interconectadas en las células tratadas con metformina y redes altamente fragmentadas en las células tratadas con metformina CCCP Baf.

El grupo de metformina CCCP Baf mostró una actividad de fisión y fusión significativamente mayor que los grupos de control o de metformina sola, lo que sugiere un aumento de la remodelación mitocondrial. Este grupo también tenía un recuento mitocondrial significativamente más alto, consistente con una mayor fragmentación. El volumen mitocondrial se redujo significativamente en el mismo grupo, lo que respalda aún más un cambio hacia la fisión.

Sin embargo, cuando se normalizó al número mitocondrial, el grupo de metformina sola exhibió la actividad dinámica relativa más alta, lo que sugiere que la metformina sola promueve una red de remodelación más activa y eficiente, mientras que el cotratamiento impulsa un recambio estructural extenso pero menos eficiente.