Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Este protocolo demuestra cómo obtener imágenes de eventos dinámicos en embriones tempranos de C. elegans mediante óptica DIC Norky o fluorescencia, utilizando microscopios ampliamente disponibles y software de código abierto. El protocolo comienza describiendo cómo diseccionar embriones de C. elegans y montarlos para su observación. A continuación, se revisa la configuración adecuada de la óptica DIC con máscara Norky para garantizar imágenes óptimas con el máximo detalle.

La calibración de la fluorescencia epifluorescente de campo amplio y de la iluminación también se revisa para obtener buenos datos de imágenes fluorescentes, combinada con software de código abierto. Una buena microscopía puede visualizar la dinámica celular en un embrión en desarrollo. Las ilustraciones visuales de este método son fundamentales, ya que configurar correctamente la óptica D iic es difícil debido a que la terminología puede ser confusa y la técnica adecuada es difícil de describir por escrito.

Además, los investigadores deben tener cuidado de minimizar la exposición a la luz durante la realización de imágenes fluorescentes. Con el fin de limitar la fototoxicidad y el fotoblanqueo, para preparar embriones para la imagenología, primero prepare dos soluciones de montaje. Una es vaselina fundida y la otra es aros al dos a 3 % en tampón.

Pueden hacerse aros más densos si las estructuras que se van a imaginar son muy frágiles, teniendo cuidado de evitar la ebullición. Ambas soluciones stock se funden en el microondas y luego se almacenan en alícuotas de cuatro a cinco mililitros. El día del análisis de imágenes, derrita una alícuota de la solución de Vaseline en un bloque térmico de 65 a 70 grados Celsius y derrita una alícuota de la solución de arose en el microondas.

Nuevamente, evite hervir. Luego, para mantener estas soluciones fundidas, guárdelas en un bloque térmico. A continuación, cubra la parte superior e inferior de dos portaobjetos con una tira de cinta de laboratorio y coloque un portaobjetos limpio entre los dos portaobjetos con cinta.

Ahora coloque unas gotas del aros fundido sobre un portaobjetos limpio y cúbralo con otro portaobjetos limpio. El aros se extiende formando una almohadilla cuadrada delgada junto con la almohadilla de gusanos preparada. Utilice un microscopio estereoscópico y una aguja de platino para transferir dos gusanos adultos a una gota de nueve a doce microlitros de tampón sobre un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros.

Luego corte. Abra los gusanos con una aguja o un escalpelo para liberar los embriones con el lado de agar hacia abajo. Coloque la almohadilla de gusanos sobre la cubreobjetivo de 18 por 18 milímetros y elimine con una cuchilla cualquier exceso de agar.

Finalmente, para sellar la cubierta, aplique la solución de vaselina fundida a lo largo de su perímetro con un pincel o palillo. Las células ya están listas para la obtención de imágenes. Al colocar la preparación en el microscopio, asegúrese de que los dos polarizadores estén alineados perpendicularmente entre sí.

Asegúrese de que tanto los diafragmas como los prismas estén fuera del trayecto del haz de luz. Si el campo no está oscuro, gire el polarizador situado debajo del condensador hasta que lo esté. Localice los embriones utilizando el objetivo de 10 aumentos.

Busque cerca de los cuerpos de los gusanos grupos de embriones jóvenes para obtener múltiples embriones dentro del campo de imagen. Evite los embriones dentro del gusano para obtener las mejores imágenes. Una vez localizados los mejores embriones, cambie a un objetivo de mayor potencia.

Ahora cambie el cubo de filtro a DIC. A continuación, inserte el prisma de Waldsheim del objetivo superior en la trayectoria de luz y gire la rueda del condensador para seleccionar el prisma de Waldsheim inferior que coincida con el objetivo. Con los prismas colocados, ajuste el deslizador debajo de esta torreta para que coincida con la apertura numérica de la lente.

Para obtener una iluminación de Köhler óptima, enfoque el condensador hasta que el borde del diafragma del condensador aparezca más nítido. El punto más nítido es cuando el límite entre la luz y el negro es más definido o está más enfocado. Para obtener un contraste óptimo, ajuste la pared de manzana y el prisma girando el botón del control deslizante.

Ahora el microscopio está casi listo para usarse. Es momento de controlar parámetros adicionales de imagen mediante la computadora con el software micromanager y de código abierto. Comience estableciendo la ganancia de la cámara en cero.

Luego cambie a guardar los archivos como TIFF de ocho bits, no de 16 bits. Los archivos TIFF pueden analizarse posteriormente mediante software de código abierto como ImageJ. A continuación, ajuste el nivel de luz hasta que los píxeles más brillantes estén justo por debajo de los niveles de saturación. Si todo se ha realizado correctamente, la imagen tendrá aspecto tridimensional, como si la luz incidiera en un ángulo determinado.

Ahora que la imagen luce brillante, seleccione los embriones que desea observar e dibuje una región de interés. Si el microscopio tiene un motor de enfoque, utilícelo para recopilar múltiples planos focales en cada momento. Abra la ventana de adquisición multidimensional y establezca los planos superior e inferior del corte en Z ajustando el mando de enfoque para encontrar el primer y último plano focal en el que se observen granulos de yema enfocados.

Establezca el tamaño del paso. Esto definirá el número de planos focales recopilados. Ahora, establezca un intervalo de tiempo suficientemente largo para adquirir todos los planos focales.

Los puntos de tiempo máximos pueden establecerse muy altos para que el software tome imágenes hasta que se detenga manualmente. Configure el software para que muestre solo la última imagen adquirida, de modo que se pueda supervisar el proceso. Ahora asigne un nombre de archivo a las imágenes y comience a adquirirlas.

Al final de la siguiente sección se revisará brevemente el análisis de imágenes. La construcción de una película GFP es muy similar a la creación de cuatro DIC D nor Musky, pero se utiliza un archivo de configuración que incluye el control de software del obturador fluorescente. Una vez localizados los embriones, asegúrese de que el prisma walstone superior no esté en la trayectoria del haz de luz y cambie el cubo de filtros a F-I-T-C-G-F-P.

Si esto no se configuró automáticamente al iniciar mediante el software, asegúrese de que la ganancia de la cámara esté ajustada a 255. Un archivo de imagen se establece en formato tiff de 16 bits. Ahora apague la fuente de luz transmitida y haga clic en imagen en vivo.

Ajuste la intensidad de la fuente de luz UV y el tiempo de exposición para obtener una buena relación señal-ruido para la señal de fluorescencia; sin embargo, mantenga la exposición a la luz al mínimo para preservar las células. A continuación, configure el intervalo de tiempo. El número de puntos temporales y el número de planos focales proceden ahora con la adquisición de imágenes como se describió anteriormente.

Para analizar las películas, utilice software de código abierto. ImageJ con el complemento micromanager instalado. Las películas muy grandes también pueden importarse a ImageJ utilizando el complemento loci. Este es un embrión de tipo salvaje capturado sin máscara, con óptica DIC.

La parte posterior se encuentra en la parte inferior derecha y la parte ventral en la parte inferior izquierda. La película muestra una secuencia de imágenes de un solo plano focal recopiladas cada 15 segundos. La reproducción se establece en 14 cuadros por segundo.

Este embrión expresa fluorescencia durante la primera división embrionaria; aquí, la parte posterior se encuentra en la esquina superior derecha. Esta película muestra los cambios en un plano focal único cada 10 segundos. Tras ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo obtener imágenes de embriones vivos utilizando tanto óptica DIC Naski como fluorescencia epiescopia para estudiar eventos dinámicos.

Esperamos que tenga una mejor comprensión de cómo configurar la óptica DIC Nomars para obtener imágenes óptimas y se dé cuenta de que puede obtener datos fluorescentes de alta calidad utilizando iluminación de fluorescencia en epifluorescencia, sin depender siempre de microscopios más avanzados. También puede aplicar estas técnicas de imagen para examinar embriones que carecen de la función específica de un gen, con el fin de investigar más a fondo los requisitos genéticos para los fenómenos de su interés durante la división celular o el desarrollo.