Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Este protocolo demuestra cómo obtener imágenes de eventos dinámicos en embriones tempranos de CL egan con óptica Norky DIC o fluorescencia mediante el uso de microscopios ampliamente disponibles y software de código abierto. El protocolo comienza con la descripción de cómo diseccionar embriones de CL gans y montarlos para la obtención de imágenes. A continuación, se revisa la configuración adecuada de la óptica DIC ni de enmascaramiento para garantizar imágenes óptimas con el máximo detalle.

También se revisa la calibración de la epifluorescente de campo amplio y la iluminación para recopilar buenos datos de imágenes fluorescentes junto con software de código abierto. Una buena microscopía puede visualizar la dinámica celular en un embrión en desarrollo. Las ilustraciones visuales de este método son críticas, ya que la configuración adecuada de la óptica es difícil, ya que la terminología puede ser confusa y la técnica adecuada es difícil de describir en forma escrita.

Además, los investigadores deben tener cuidado de minimizar la exposición a la luz al realizar imágenes fluorescentes. Con el fin de limitar la fototoxicidad y el fotoblanqueo Para preparar los embriones para la obtención de imágenes, primero, haga dos soluciones de montaje. Uno es vaselina derretida y el otro es de dos a 3%aros en tampón.

Se pueden hacer aros más densos si las estructuras a fotografiar son muy frágiles, teniendo cuidado de evitar la ebullición. Ambas soluciones madre se derriten en el microondas y luego se almacenan como alícuotas de cuatro a cinco mililitros. El día de la toma de imágenes, derrita una alícuota de solución de vaselina en un bloque de calor de 65 a 70 grados Celsius y derrita una alícuota de solución rosada en el microondas.

De nuevo, evitando hervir. Luego, para mantener estas soluciones fundidas, guárdelas en un bloque de calor. A continuación, cubra la parte superior e inferior de dos portaobjetos con una tira de cinta de laboratorio y coloque un portaobjetos limpio entre los dos portaobjetos con cinta adhesiva.

Ahora coloque unas gotas de los aros fundidos en el portaobjetos limpio y cúbralo con otro portaobjetos limpio. El Aros se extiende en una almohadilla cuadrada delgada con la almohadilla de gusano preparada. Use un telescopio de disección y un pico de alambre de platino para transferir dos gusanos adultos a una gota de tampón de nueve a 12 microlitros en un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros.

Luego corte. Abre los gusanos con una aguja o bisturí para liberar los embriones con el agarro hacia abajo. Coloque la almohadilla helicoidal en el cubreobjetos de 18 por 18 milímetros y retire cualquier agar que sobresalga.

Finalmente, para sellar el cubreobjetos, aplique la solución de vaselina fundida a lo largo de su perímetro con un pincel o un palillo. Las células ya están listas para la toma de imágenes. Cuando coloque el portaobjetos en el microscopio, asegúrese de que los dos polarizadores estén alineados perpendicularmente entre sí.

Asegúrese de que tanto los muros como los prismas estén fuera de la trayectoria de la luz. Si el campo no está oscuro, gire el polarizador debajo del condensador hasta que esté ahora. Encuentra los embriones usando el objetivo de 10 veces.

Busque cerca de los cuerpos de los gusanos grupos de embriones jóvenes para obtener varios embriones dentro del campo de imágenes. Evite los embriones dentro del gusano para obtener las mejores imágenes. Con los mejores embriones localizados, cambie a un objetivo de mayor potencia.

Ahora cambie el cubo de filtro a DIC. A continuación, inserte el prisma de Walstone del objetivo superior en la trayectoria de la luz y gire la tarta del condensador para seleccionar el prisma de Walstone inferior que coincida con el objetivo. Con los prismas en su lugar, ajuste el control deslizante debajo de esta torreta para que coincida con la apertura numérica de la lente.

Para obtener la iluminación Kohler óptima, enfoque el condensador hasta que el borde del diafragma del condensador parezca más afilado. El más nítido es cuando el límite entre el negro claro es más nítido o está más enfocado. Para obtener un contraste óptimo, ajuste la pared y el prisma de la manzana girando la perilla en el control deslizante.

Ahora el microscopio está casi listo para usar. Es hora de controlar los parámetros de imagen adicionales en la computadora con micromanager y software de código abierto. Comience configurando la ganancia de la cámara a cero.

A continuación, cambie a guardar los archivos como tiffs de ocho bits, no de 16 bits. Los archivos TIFF pueden ser analizados posteriormente por software de código abierto como Image J.A continuación, ajuste el nivel de luz a donde los píxeles más brillantes están justo por debajo de los niveles de saturación. Si todo se ha hecho correctamente, la imagen se verá en 3D con la luz que parece brillar en ángulo.

Ahora que la imagen se ve brillante, seleccione los embriones que desea visualizar y dibuje una región de interés. Si el microscopio tiene un motor de enfoque, utilícelo para recoger varios planos focales a la vez. Apunte a abrir la ventana de adquisición multidimensional y establezca el plano superior e inferior de la pila Z ajustando la perilla de enfoque para encontrar el primer y el último plano focal con algunos gránulos de yugo enfocados.

Establezca el tamaño del paso. Esto definirá el número de planos focales recopilados. Ahora, establezca un intervalo de tiempo que sea lo suficientemente largo como para adquirir todos los planos focales.

Los puntos de tiempo máximos se pueden establecer muy altos para que el software tome imágenes hasta que se detenga manualmente. Configure el software para que muestre solo la última imagen adquirida para que se pueda monitorear el proceso. Ahora asigne un nombre de archivo a las imágenes y comience a adquirir imágenes.

El análisis de imágenes se revisará brevemente al final de la siguiente sección. Construir una película GFP es muy parecido a hacer cuatro D ni Musky DIC, pero se utiliza un archivo de configuración que incluye el control de software de la rotura fluorescente. En cambio, con los embriones localizados, asegúrese de que el prisma superior de Walstone no esté en la trayectoria de la luz y cambie el cubo de filtro a F-I-T-C-G-F-P.

Si esto no se configuró automáticamente al iniciar usando el software, asegúrese de que la ganancia de la cámara esté configurada en 255. Un archivo de imagen se establece en formato tiff de 16 bits. Ahora apague la fuente de luz transmitida y haga clic en imágenes en vivo.

Ajuste la intensidad de la fuente de luz UV y el tiempo de exposición para lograr una buena relación señal-ruido para la señal de fluorescencia, sin embargo, mantenga la exposición a la luz al mínimo para preservar las células. A continuación, configure el intervalo de tiempo. El número de puntos de tiempo y el número de planos focales ahora proceden con la adquisición de imágenes como se describió anteriormente.

Para analizar las películas, utilice software de código abierto. Imagen J con el plugin micromanager instalado También se pueden importar películas muy grandes a Image J utilizando el plugin de loci. Se trata de un embrión de tipo salvaje capturado con óptica DIC no enmascarada.

La parte posterior está en la parte inferior derecha y la ventral en la parte inferior izquierda. La película muestra una secuencia de imágenes de plano focal único recopiladas cada 15 segundos. La reproducción se establece a 14 fotogramas por segundo.

Este embrión expresa fluorescencia durante la primera división embrionaria, aquí la parte posterior está en la parte superior derecha. Esta película muestra los cambios en un solo plano focal cada 10 segundos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de embriones vivos utilizando tanto la óptica DIC Naski como la epifluorescencia para estudiar eventos dinámicos.

Esperamos que comprenda mejor cómo configurar la óptica DIC Nomar para obtener imágenes óptimas y se dé cuenta de que puede obtener datos fluorescentes de alta calidad utilizando la iluminación de epifluorescencia, y no siempre depende de microscopios más avanzados. También puede aplicar estas técnicas de imagen para examinar embriones que carecen de una función genética específica para investigar más a fondo los requisitos genéticos de sus eventos favoritos durante la división celular o el desarrollo.