Método optimizado para el cultivo y la bioaumentación microbiana de Typha latifolia (totora)

Nuestro trabajo aborda la falta de protocolos para cultivar la espada a partir de semilla. Desarrollamos métodos reproducibles para la germinación de semillas, el crecimiento temprano y la bio-augmentación microbiana para apoyar la futura investigación de microbios vegetales. Pocos estudios cultivan la espada desde semilla o la rastrean hasta su madurez, pero las espadañas se utilizan comúnmente en investigaciones de remediación de humedales.

La mayoría de la investigación sobre la espada consiste en comprar rizomas para su propagación en estudios de laboratorio. Pocos estudios cultivan la espada a partir de semilla, sin métodos estandarizados. Lograr una germinación constante y una colonización persistente de los microbios introducidos ha sido un gran desafío.

Hemos desarrollado métodos reproducibles para la germinación de semillas y la bio-augmentación microbiana, demostrando cómo la inoculación temprana ayuda a apoyar la colonización a largo plazo. Para empezar, utiliza tijeras de jardín para cortar el tallo de una planta de Typha latifolia aproximadamente a dos centímetros de la base de la inflorescencia. Retira las semillas de la inflorescencia, transfiere la semilla a una batidora de laboratorio hasta que la batidora esté aproximadamente 1/4 llena, lo que corresponde a unos 250 mililitros de semillas sin compactar.

Ahora llena la batidora con 500 mililitros de agua del grifo, asegurando que se mantenga un espacio de cabeza de 10 centímetros. Mezcla la mezcla a velocidad media y baja durante 20 segundos y transfiere inmediatamente el contenido viscoso a un vaso de precipitados de un litro. Transfiere aproximadamente 100 mililitros de la mezcla de agua de semillas de nuevo a la batidora.

Luego añade entre 400 y 600 mililitros de agua fresca del grifo y licúa a velocidad media alta durante 20 segundos. Vierte el contenido en un vaso fresco de un litro. Ahora llena el vaso con agua del grifo hasta 800 mililitros.

Después de dejarlo reposar durante 60 segundos, retira el lodo flotante de la parte superior sin molestar las semillas que se asientan en el fondo. Vierte lentamente el agua restante y transfiere las semillas a un vaso de precipitados de 100 mililitros. Repite el proceso de mezcla para el lodo de agua de semilla que queda. A continuación, coloca el vaso que contiene las semillas separadas sobre una placa para agitar.

Después de remover, recoge cualquier material vegetal flotante de la superficie del vaso de precipitados. Vierte las semillas en un embudo Buchner con papel de filtro sujeto al vacío y déjalas secar toda la noche. Guarda las semillas secas a 20 grados Celsius en tubos cónicos de polipropileno de 50 mililitros.

Prepara placas de medios Murashige y Skoog a media concentración con agar de fitofitona al 1%. Transfiere aproximadamente un miligramo de las semillas secas a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros. Luego añade 10 mililitros de agua estéril doble destilada al tubo.

Coloca el tubo sobre un agitador orbital a velocidad media alta durante 10 minutos. Ahora retira el agua del tubo y añade cinco mililitros de solución de polisorbato 20 al 0,1% preparada en agua estéril doble destilada. Sacude el tubo a velocidad media alta durante 10 minutos.

Retira la solución de polisorbato 20. Realiza todos los pasos posteriores delante de una campana de llama o de flujo laminar. Sustituye la solución por cinco mililitros de lejía comercial al 30% y solución de polisorbato 20 al 0,025% preparados en agua estéril doble destilada.

Sustituye el sobrenadante por agua estéril doble destilada. Luego agita el tubo a velocidad media alta durante cinco minutos. Después del tercer enjuague, gira el tubo a baja velocidad durante 24 horas para inducir la germinación.

Al día siguiente, retira el exceso de agua y asegúrate de que queden tres mililitros de líquido en el tubo. Ahora, asépticamente, corta la punta de una pipeta de plástico de 1000 microlitros. Usa la punta cortada de la pipeta para pipetear vigorosamente y suspender las semillas dentro de la punta.

Emplata las semillas y el líquido en placas de agar Murashige y Skoog a mitad de concentración. Gira suavemente el plato para distribuir las semillas de forma uniforme. Envuelve las placas con película de sellado de laboratorio y luego colócalas en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz de 16 horas y un ciclo de oscuridad de 8 horas a 23 grados Celsius y 70% de humedad.

Para inocular las semillas de la espada, esteriliza las semillas con lejía polisorbato 20 y agua destilada doblemente, como se ha demostrado. Mide la densidad óptica de un cultivo nocturno de aislamiento de Luteimonas a 600 nanómetros. Normaliza el cultivo a un valor de absorbancia de 1,0 diluyendo en el medio de cultivo.

Ahora centrifuga un mililitro de cultivo a 9.300 g durante dos minutos. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en un mililitro de PBS. Tras centrifugar y retirar de nuevo el sobrenadante, resuspende el pellet bacteriano en un mililitro de agua estéril doble destilada.

Usa semillas esterilizadas y luego diluye el inóculo en una dilución de uno a diez con un tensioactivo organosiliconado al 0,025% en el mismo tubo. Agita la suspensión a baja velocidad durante 24 horas antes de la germinación de la semilla. Empieza llenando una unidad de cámara de crecimiento vegetal estéril con un suelo pre-humedecido con agua del grifo.

Cubre la punta Luer Lock con papel de aluminio y autoclave la unidad en un ciclo líquido durante 20 minutos. A continuación, en condiciones estériles, se conecta una unidad de filtro de 0,2 micrómetros al conector Luer lock en la cámara de crecimiento. Abre la cámara y añade 500 microlitros de fertilizante esterilizado con filtro 1%20 por 20 por 20 al suelo.

Mezcla la tierra con una espátula estéril mientras añades al mismo tiempo agua estéril doble destilada para mantener la hidratación sin saturar la tierra. Ahora, usa una cuchilla de afeitar estéril para cortar ágar Murashige y Skoog de placas que contienen una débil plántula vieja en cuartos. Con una espátula estéril, transfiere una sección de agar con plántula sobre el suelo preparado en la cámara de crecimiento.

Transfiere la unidad de la cámara de crecimiento a un incubador de plantas configurado en un ciclo de luz de 16 horas y un ciclo de oscuridad de 8 horas a 23 grados Celsius y 70% de humedad. La escarificación completa de las semillas de Typha resultó en componentes visiblemente separados, mientras que la escarificación incompleta dejó el pico unido y las semillas no escarificadas permanecieron intactas. Se ha demostrado que el sistema hidropónico estéril favorece el crecimiento de especies de torña y juncus, aquí identificadas como juncus, que se mantuvo dentro del sistema estéril hasta un año.

Se observó la mayor tasa de germinación de semillas, del 20,8%, utilizando el método de lejía al 30% y polisorbato 20, que fue significativamente mayor que en todos los demás tratamientos de esterilización, excepto el método de gas cloro de 1 hora, que no logró la esterilización completa de las semillas. A los siete días de la escarificación, las plántulas germinantes de Typha desarrollaron radicales visibles y tejido de brotes en el entorno de placas de Petri no estériles. Tras el trasplante al suelo, un subconjunto de plántulas de Typha se estableció con éxito y produjo nuevo tejido de brotes en una a dos semanas.

Tras la inoculación con especies de Luteimonas portadoras de un plásmido DsRed, se observó colonización bacteriana fluorescente roja en todas las raíces de la plántula de Typha a los 16 días de la inoculación.