Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Este estudio tiene como objetivo desarrollar tejidos cardíacos biométricos en 3D utilizando andamios eléctricos fundidos y células cardíacas derivadas de iPSC humanas para mejorar el modelado de enfermedades, las pruebas de fármacos y las aplicaciones de medicina regenerativa. El informe inducido por el ser humano en los cardiomiocitos de células madre permanece inmaduro, lo que limita su funcionalidad. Además, es un desafío reproducir la gran complejidad requerida para modelar el tejido cardíaco en 3D.

Este modelo imita mejor el miocardio nativo, lo que permite interacciones complejas de la matriz extracelular en 3D para el modelado de enfermedades, pruebas de fármacos y aplicaciones específicas de pacientes. Ofrece una alternativa más relevante a los cultivos 2D y los modelos animales. En el futuro, nuestra investigación se centrará en la investigación de modelos de cardiomicología, la mejora de los protocolos de maduración de tejidos en 3D y el desarrollo de construcciones más grandes para terapias preclínicas de infarto de miocardio en modelos animales grandes como los cerdos.

Para empezar, conecte la jeringa a un tubo de suministro de nitrógeno presurizado e introdúzcala dentro de la cámara de calentamiento. Encienda el equipo de escritura de electrohilado de fusión y ajuste los reguladores de temperatura a 80 grados centígrados para la cámara y 65 grados centígrados para la boquilla. Después de 30 minutos, mueva la placa colectora hasta que el cabezal de impresión se coloque en un borde de la placa o en cualquier ubicación deseada.

Ajuste la distancia entre la cámara de calentamiento y la placa colectora manualmente a 10 milímetros en el plano z. Cierre la puerta del equipo, que conecta automáticamente el suministro de campo eléctrico. Ajuste el voltaje a siete kilovoltios en presión de nitrógeno a dos bares para la extrusión a través de la punta del calibre 23.

Cargue el código G del diseño en el software para imprimir andamios con una geometría de patrón cuadrado. Ajuste la velocidad del colector a 1080 milímetros por minuto. A continuación, pulse el botón de inicio de ciclo para iniciar la impresión.

Una vez finalizada la impresión, retire con cuidado el andamio del colector. Corte la malla impresa con un punzón de seis milímetros de diámetro para obtener los andamios finales para la fabricación de tejidos. Trate los andamios durante cinco minutos con plasma de oxígeno.

Esterilizar las mallas sumergiéndolas en etanol al 70% durante 30 minutos. Lavar abundantemente con agua destilada estéril durante 30 minutos, luego dejar secar. Después de separar los cardiomiocitos iPSC humanos, vuelva a suspender la célula en el medio de generación de tejido y cuente las células utilizando la cámara de Neubauer.

Del mismo modo, después de separar los fibroblastos cardíacos iPSC humanos, vuelva a suspender la célula en el medio de generación de tejido y cuente las células. Mezcle el total de células necesarias en un tubo nuevo y consulte el contenido como Mezcla de células. Y centrifugar a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, vuelva a suspender la mezcla de células en el volumen requerido de medio de generación de tejido. Para generar la mezcla de hidrogel, agregue el volumen requerido de fibrinógeno al tubo a temperatura ambiente y mezcle cuidadosamente. Siembre la mezcla de hidrogel sobre una superficie de politetrafluoroetileno para evitar la adhesión de la fibrina a la placa.

Pipetear la mitad del volumen del tejido, dejándolo en forma de gota. Coloque un andamio de policaprolactona, o PCL, encima de cada gota y agregue el volumen restante al andamio. Ahora, agregue la cantidad requerida de trombina y mezcle rápidamente el hidrogel, evitando cuidadosamente las burbujas.

Incubar los tejidos a 37 grados centígrados durante una hora para completar la polimerización de la fibrina. Levante suavemente cada tejido por el borde con pinzas estériles y transfiéralos a placas de 12 pocillos que contengan medio de generación de tejido suplementado con aprotinina. Incubar los tejidos a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, refresque el medio con dos mililitros de medio de mantenimiento de tejidos, eliminando los residuos de KSR e Y-27. La siembra de una mezcla de ocho a dos de cardiomiocitos iPSC humanos y fibroblastos cardíacos iPSC humanos en hidrogeles de fibrina da como resultado una distribución celular uniforme a través de los poros del andamio dentro de una hora después de la polimerización. Las imágenes de inmunofluorescencia confocal mostraron una distribución celular mixta de las células a través del tejido 3D que interactúa con el andamio PCL con la mayoría de los cardiomiocitos iPSC humanos teñidos para actinina sarcomérica interespaciados con fibroblastos cardíacos iPSC humanos marcados con vimentina.

Los cardiomiocitos iPSC humanos exhiben una estructura de sarcómero bien organizada por la proteína actinina sarcomérica espaciada regularmente. Las células comenzaron a latir espontáneamente al segundo día con una frecuencia media de latidos de 30 latidos por minuto al séptimo día, mostrando una contracción estabilizada en toda la malla. Se observó una disminución gradual a lo largo del tiempo, alcanzando 17 BPM para el día 14.

A pesar de esto, la actividad metabólica se mantuvo estable entre el día siete y el día 14, lo que confirma la viabilidad celular sostenida. Finalmente, el análisis de puntos de seguimiento de los tejidos batientes mostró una velocidad de contracción de 38 micrómetros por segundo y una amplitud de contracción de 29 micrómetros.