Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

El objetivo general de este procedimiento es crear tejidos cardíacos de ingeniería humana de una composición celular definida. Este método puede abordar desafíos clave en el campo de la ingeniería de tejidos cardíacos, incluido el control de la variabilidad y la eficiencia de la diferenciación cardíaca y la comprensión de cómo tipos específicos de células afectan la función contráctil cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que el resultado final es tejido cardíaco diseñado por humanos de una composición controlada y definida.

Las réplicas de esta técnica se extienden hacia la terapia para la enfermedad cardíaca porque los tejidos definidos pueden proporcionar una plataforma de detección biomédica novedosa, biológicamente relevante y capaz de evaluar intervenciones terapéuticas. Aunque este método puede proporcionar información sobre nuevas terapias cardíacas, el sistema de tejido cardíaco diseñado por humanos también se puede utilizar para comprender los mecanismos de la terapia celular cardíaca. Comenzando con cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas, lave las células una vez con PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA al 0,04%.

Incubar las células durante 10 minutos a 37 grados centígrados y 5%CO2. Cuando las células estén incubando, agregue 12 microlitros de inhibidor de ROCK a seis mililitros de solución de neutralización de tripsina. Retire las placas de la incubadora y agregue un mililitro de la solución de neutralización a cada pocillo de la placa de seis pocillos.

Transfiera todas las celdas de cada pocillo a un solo tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave los seis pocillos con un volumen de tres mililitros de PBS y combine este lavado con las células del tubo. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para peletizar las células.

Para preparar las células para la clasificación de células vivas por FACS, prepare el tampón de tinción añadiendo cinco mililitros de FBS y 50 microlitros de inhibidor de ROCK a 45 mililitros de PBS en hielo. Retire el sobrenadante de las células peletizadas y vuelva a suspenderlas en 1,2 mililitros de tampón de tinción. Transfiera 200 microlitros de las celdas suspendidas a un nuevo tubo de centrífuga preenfriado de 50 mililitros sobre hielo.

A continuación, transfiera el mililitro restante de la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga preenfriado de 50 mililitros en hielo y agregue dos microlitros de SIRP alfa-PE/Cy7 y cuatro microlitros de anticuerpos CD90-FITC. Mezcle suavemente la suspensión celular con una pipeta de transferencia y coloque el tubo sobre hielo. Incubar los dos tubos de 50 mililitros que contienen el control negativo y la muestra en un agitador basculante sobre hielo a cuatro grados centígrados durante una hora.

Mientras las células se incuban, transfiera tres mililitros de medio de diferenciación dos a cada uno de los dos tubos de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, añada tres microlitros de inhibidor de ROCK y almacene estos tubos de recogida de FACS en hielo antes de usarlos. A continuación, granule las células teñidas a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Y lávalos dos veces con 10 mililitros de PBS helado. Vuelva a suspender suavemente el gránulo de muestra con uno a tres mililitros de tampón de tinción que contenga DAPI. Agregue 500 microlitros de tampón de tinción sin DAPI al pellet de control negativo.

Filtre ambas suspensiones celulares a través de un filtro celular de 40 micras para eliminar los grumos celulares y luego transfiéralas a tubos FACS de poliestireno en hielo. Lleve inmediatamente las muestras al clasificador de células. Comenzando con la muestra de control de tinción negativa, establezca los parámetros de compuerta.

A continuación, mientras ejecuta las celdas de muestra, seleccione la población de células vivas negativas DAPI. Recoja las poblaciones de células positivas para FITC y positivas para PE/Cy7 de forma independiente a 20 PSI. Después de cultivar y reagregar las células, como se indica en el protocolo de texto, retire las placas de cultivo celular de la incubadora y transfiera el medio a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Lave las placas con tres mililitros de PBS y transfiera el lavado al mismo tubo de centrífuga de 50 mililitros. A continuación, añadir tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,04% a las placas e incubar a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de cinco minutos, examine las placas para detectar el desprendimiento de células con un microscopio.

Una vez que todas las células se hayan desprendido, agregue tres mililitros de solución de neutralización de tripsina a las placas. Mezcle suavemente y transfiera las celdas al tubo de centrífuga original de 50 mililitros. Lave las placas con cinco mililitros de PBS y agregue este lavado también al tubo.

Granular las células por centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de suero bovino neonatal, o medio NBS. A continuación, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Granule las células a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante. Para comenzar a generar los seis tejidos cardíacos diseñados, diluya 60.0 microlitros de los cinco miligramos por mililitro de colágeno a 3.125 miligramos por mililitro con 1.5 microlitros de hidróxido de sodio molar, 9.6 microlitros de PBS 10X y 24.9 microlitros de agua ultrapura estéril. En este caso, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla de colágeno, ya que las burbujas de aire tardan en desprenderse de la solución viscosa y pueden interferir con la formación de tejido durante la compactación del tejido.

Pipetea por el costado del tubo de 15 mililitros para agregar 12.0 microlitros de 10X MEM y 0.2 montones normales a pH 9 para diluir la mezcla de colágeno. A continuación, añada la matriz de la membrana basal a la mezcla de colágeno hasta una concentración final de 0,9 miligramos por mililitro y mezcle suavemente. Guarde esta mezcla final de pañuelos en hielo.

A continuación, transfiera toda la mezcla de tejidos al pellet de celdas y agregue celdas suplementarias como se indica en el protocolo de texto. Llene el tubo hasta un volumen final de 150 microlitros con medios NBS sin células y mezcle suavemente. Pipetee cuidadosamente 25 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los seis pocillos de la placa base del biorreactor.

Repita el procedimiento de mezcla entre cada pocillo para resuspender las células que puedan haberse asentado. Pipetea solo un tejido por pocillo a la vez para garantizar un volumen y un número de células por tejido constantes. Por separado, empuje dos filas de polidimetilsiloxano, o PDMS, forzando los sensores a cada lado del marco de polisulfona para formar seis pares de postes opuestos.

Invierta el marco en la parte superior de la placa base de modo que un par de postes ingrese a cada pozo que contenga la suspensión de la celda. Luego coloque el biorreactor en un plato de 60 milímetros y coloque ese plato sin su tapa dentro de un plato de 10 centímetros. Coloque la tapa en el plato de 10 centímetros y mueva todo el conjunto del biorreactor a la incubadora de cultivo de tejidos.

Después de dos horas de incubación, retire el conjunto del biorreactor y agregue 14 mililitros de medio NBS para cubrir la placa base. Regrese el biorreactor a la incubadora de cultivos celulares y cambie la mitad del medio todos los días. Después de 48 horas, retire la placa base suavemente unos milímetros a la vez.

A continuación, devuelva el biorreactor con el tejido hacia abajo al medio. Si un pañuelo se cae de un poste al retirar la placa base, vuelva a colocar suavemente el pañuelo en el poste. La diferenciación de las células madre embrionarias humanas da como resultado un cultivo mixto de cardiomiocitos y fibroblastos que se autoorganizan en grupos y forman redes que golpean de manera robusta en todo el plato.

La clasificación FACS de estos cultivos reveló que este método de diferenciación da como resultado una población que contiene al menos un 65% de células alfa positivas para SIRP y un 10% de células positivas para CD90. Después de retirar la placa base, se permite que los tejidos cardíacos de ingeniería humana, o HECT, se autoensamblen dentro del biorreactor. Los HECT maduros y compactados desvían visiblemente los postes de detección de fuerza integrados con un promedio de cinco a 15 micronewtons de fuerza.

Las mediciones de la fuerza de contracción revelan cómo variables aisladas alteran la fuerza contráctil en estos tejidos de ingeniería definidos. Aquí, cuando los tejidos se suplementan con un 10% de células madre mesenquimales humanas, se observa un aumento sustancial de la fuerza contráctil tanto en las frecuencias de estimulación de un hercio como de dos hercios. Una vez dominada, la diferenciación tomará aproximadamente 20 días, la clasificación de la célula alrededor de cinco horas y la construcción del tejido alrededor de tres horas.

Se necesitarán otros siete días para la formación adecuada de tejido después de la construcción. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el marcaje celular y la suplementación de la mezcla de tejidos, para responder a preguntas adicionales sobre los efectos de interacciones específicas entre células o para determinar los mecanismos de la terapia celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear tejidos cardíacos de ingeniería humana con una composición celular conocida y controlada.