Name: Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprende a construir tejidos cardíacos humanos definidos mediante marcadores de superficie y FACS para estudiar mecanismos de terapia celular cardíaca. Este método proporciona un modelo funcional controlado.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH (1F30HL118923-01A1) a la Joint Commission, NIH / NHLBI PEN contrato HHSN268201000045C al KDC, el consejo beca de investigación de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), el NIH (R01 HL113499) para BDG, la American Heart Association (12PRE12060254) a RJ, y del Consejo de Investigación de subvención de la RAE (TBR, T13-706 / 11) en RL financiación adicional fue proporcionada por el NIH para TJC DRB 5T32GM008553-18 y como un periodo de prácticas de Formación NIDCR-Interdisciplinario en Sistemas y Desarrollo biología y defectos congénitos T32HD075735. Los autores también desean expresar su agradecimiento por Arthur Autz en el Centro de Zahn El City College de Nueva York para obtener ayuda con el mecanizado del biorreactor y Mamdouh Eldaly para la asistencia técnica. También agradecemos al Dr. Kenneth Boheler para el asesoramiento sobre la diferenciación cardiaca, y el Dr. Joshua Hare generosamente para proporcionar células madre mesenquimales humanas.

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<li>Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).</li>
<li>Yildirim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+biological+ventricular+assist+device%3A+preliminary+data+from+a+small+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model.</a> Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Cell+Sheet+Transplantation+Improves+Damaged+Heart+Function+via+Superior+Cell+Survival+in+Comparison+with+Dissociated+Cell+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection.</a> Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li>
<li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+tissue-engineered+human+vascularized+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Turnbull, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+functional+engineered+cardiac+tissues+toward+a+preclinical+model+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium.</a> FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).</li>
<li>Thavandiran, N., Dubois, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+formulation+of+functional+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PloS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
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<li>Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS One. 7 (5), e38147(2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
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<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).</li>
<li>Dubois, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Gago-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THY-1+receptor+expression+differentiates+cardiosphere-derived+cells+with+divergent+cardiogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).</li>
<li>Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+dose-escalation+study+of+intravenous+adult+human+mesenchymal+stem+cells+%28prochymal%29+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).</li>
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<li>Meyer, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+bone+marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+eighteen+months%27+follow-up+data+from+the+randomized%2C+controlled+BOOST+%28BOne+marrOw+transfer+to+enhance+ST-elevation+infarct+regeneration%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial.</a> Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+mononuclear+cells+from+bone+marrow+or+peripheral+blood+compared+with+standard+therapy+in+patients+after+acute+myocardial+infarction+treated+by+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+results+of+the+randomized+controlled+HEBE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial.</a> Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li>
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<li>Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Delivery+Routes+and+Engraftment%2C+Cell-Targeting+Strategies%2C+and+Immune+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation.</a> Stem Cells Int. , 732742(2013).</li>
<li>Trachtenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+design+of+the+Transendocardial+Injection+of+Autologous+Human+Cells+%28bone+marrow+or+mesenchymal%29+in+Chronic+Ischemic+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Heart+Failure+Secondary+to+Myocardial+Infarction+%28TAC-HFT%29+trial%3A+A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study+of+safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy.</a> Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Construcción de tejidos humanos definidos por ingeniería cardíacas (hect) puede proporcionar un modelo más consistente y fiable de la función de los cardiomiocitos humanos. Fundamentalmente, todos los componentes celulares y extracelulares en el sistema son conocidos y se pueden manipular como se desee, eliminando así la influencia de confusión de otros tipos de células desconocidos que resultan del proceso de diferenciación. Para equilibrar el crecimiento celular rápido y de alto rendimiento, es preferible que la difer...

Ingeniería de tejido cardiaco ha avanzado considerablemente en la última década, con múltiples grupos editoriales resultados de tejidos totalmente funcionales, superando confeccionada con cardiomiocitos murinos 1-6 y, más recientemente, los miocitos cardíacos derivados de células madre humanas 7-12. El campo de la ingeniería de tejido cardiaco se debe a dos objetivos primarios y esencialmente independientes entre sí: 1) para desarrollar injertos exógenos que pueden trasplantarse en su defecto corazones para mejorar la función 4-6; y 2) el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de la fisiología y la enfermedad, o como instrumentos de evaluación para el desarrollo terapéutico 2,7. Tridimensional (3-D) de cultivo celular se considera esencial para el desarrollo de herramientas de detección de próxima generación, como la matriz 3-D refleja un microambiente cardiaca más natural que la cultura tradicional monocapa de células 2-D; de hecho, algunos aspectos de la biología celular son fundamentalmente diferentes en 2-D culturas vs. 3-D 13,14 </sup&gt;. Además, los tejidos cardíacos ingeniería se construyen a partir de componentes completamente definidas: una matriz extracelular, y una población de células. Para los tejidos cardíacos humanos de ingeniería tradicionales, mientras que la composición de la matriz extracelular (por lo general de fibrina o colágeno 9 7,8,10) está estrictamente controlada, la composición celda de entrada no está bien definido, con toda la mezcla de células a partir de una diferenciación cardiaca dirigido de cualquiera células madre embrionarias (ESC 7,9) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC 10,12) que se añaden a los tejidos. Dependiendo de la línea celular específica y la eficiencia del protocolo de diferenciación se utiliza, el porcentaje resultante de los cardiomiocitos puede variar desde menos de 25% a más del 90%, el fenotipo de cardiomiocitos específico (es decir, ventricular-, atrial-, o similar al marcapasos) también puede variar, aunque la fracción no cardiomiocitos puede ser muy heterogéneo 15,16 y alterar la madurez de la m cardiaca diferenciadayocytes 17. Recientes trabajos de ingeniería de tejido cardiaco ha intentado controlar la población de entrada de las células, ya sea con una superficie de la línea de células madre embrionarias humanas reportero cardiaca 8 o 18 células marcadores se utiliza para aislar el componente de los cardiomiocitos de la diferenciación. Aunque en un principio un tejido compuesto de sólo miocitos cardíacos parece ser el ideal, esto es, de hecho, no es el caso; hECTs compuestas únicamente de los miocitos cardíacos no pueden compactar en tejidos funcionales, con algunos grupos encontrar una relación 3: 1 de los miocitos cardíacos: fibroblastos producir la más alta fuerza de contracción 8. Mediante el uso de diferentes métodos de selección de células, incluyendo marcadores de la superficie para la clasificación de células en vivo, es posible crear hECTs con poblaciones de células definidas. Mientras que los marcadores de las células del estroma no cardíacas han estado disponibles durante algún tiempo, tal como el marcador de fibroblastos putativo CD90 19,20, marcadores de superficie de los miocitos cardíacos han sido más difícilesidentificar. SIRPα estaba entre los primeros marcadores de superficie cardíacos identificados para los miocitos cardiacos humanos 18 y se ha demostrado ser altamente selectivo para el linaje cardiaco. Recientemente, hemos encontrado que la doble clasificación para SIRPα + y CD90 - células rendimientos cardiomiocitos casi puros, con el CD90 + de la población que presenta un fenotipo similar a fibroblastos (Josowitz, observaciones no publicadas). Sobre la base de estos hallazgos recogidos, Aquí se describe la creación de hECTs utilizando una mezcla 3: 1 de combinación SIRPα + / CD90 - cardiomiocitos y fibroblastos CD90 +. La capacidad de diseñar un tejido cardiaco humano completamente definido es esencial no sólo para la creación de herramientas de detección sólidas, sino también para el desarrollo de sistemas modelo para investigar por células emergentes y las terapias basadas en genes cardiacos. En particular, numerosas terapias con células para la insuficiencia cardíaca, utilizando tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales (MSC) 21 </sup&gt;, las células madre cardiacas 22 y las células mononucleares de médula ósea 23-25, se han probado en ensayos clínicos. Mientras que muchos de los resultados iniciales han sido prometedores 21,23,25, el beneficio inicial con frecuencia disminuye con el tiempo 26-29. Una tendencia similar se ha reportado en los tejidos cardiacos murinos ingeniería, que muestran un beneficio funcional significativa debido a la suplementación MSC, pero el beneficio no se mantiene durante el cultivo a largo plazo 1. Subyace el rendimiento subóptimo es nuestro conocimiento limitado de los mecanismos que regulan las terapias celulares. Una comprensión más profunda de cómo las células terapéutica ejercer su influencia beneficiosa, así como las posibles consecuencias negativas de las interacciones de los miocitos-nonmyocyte, permitiría el desarrollo de mejores terapias produciendo beneficios clínicamente significativos y sostenidos, con efectos secundarios mínimos, para los pacientes con insuficiencia cardíaca. A continuación, describimos el uso de hECTs definidos para interrogcomió mecanismos de terapia basada en células. La composición del tejido controlada es esencial para identificar los factores específicos que afectan el rendimiento de los cardiomiocitos. Directamente complementar hECTs con el tipo de célula terapéutico de interés (por ejemplo, MSC), puede revelar los efectos sobre el rendimiento de miocitos cardiacos, como hemos demostrado en el ECTS rata 1. El siguiente protocolo multi-paso comienza con la diferenciación de células madre cardiaca dirigida, seguido por la fabricación del biorreactor multi-tejido, y concluyendo con una descripción de la construcción de tejidos y análisis funcional. Nuestros experimentos se realizaron con la línea de células madre de embriones humanos aprobados por el NIH H7 (células madre). Sin embargo, los siguientes protocolos también se han probado utilizando una línea de células madre adicionales y tres líneas de célula madre pluripotente inducida (hiPSC) con resultados similares. Hemos encontrado que la eficiencia en la diferenciación de los cardiomiocitos y el éxito en Hect fabricación puede ser línea celular dependiente, particularmente folíneas r hiPSC derivadas de pacientes individuales. Siguiendo este protocolo, dos placas de 6 pocillos se sembraron con un total de 1,68 millones de hESCs (140.000 células por pocillo), que produce aproximadamente 2,5 millones de miocitos después de la diferenciación durante 20 días y clasificación, lo suficiente como para hacer seis tejidos definidos.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>Prepare un stock de 2,5 mg/ml en DMSO y filtre-esterilice</td></tr><tr><td>B27 con Insulina</td><td>Life Technologies</td><td>17505055</td><td></td></tr><tr><td>B27 sin insulina</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Create 6 &mu; M stock, luego alícuota y almacenamiento a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>H7 Células madre embrionarias humanas</td><td>WiCell</td><td>WA07</td><td></td></tr><tr><td>hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel</td><td>Corning 354277</td><td></td><td>Descongelar en hielo a 4 & grados; C durante la noche luego alícuota 150 &mu; l en tubos separados y almacene a -20 &nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td>Crear stock de 10 mM y alícuota. Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero de ternero neonatal</td><td>Life Technologies</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación no enzimática: Reactivo de disociación celular suave</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Life</td><td>Technologies</td><td>11875-093</td><td>Mantener refrigerado</td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibidor de ROCK)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Volver a suspender a una concentración de stock de 10 mM, alícuota y almacenar a -20&nbsp; &deg;C. Evite los ciclos de congelación y descongelación.</td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihidrochloride (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>CD90-FITC</td><td>BioLegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación enzimática: Kit de separación de células I (0,04 % de tripsina/0,03 % de EDTA, solución de neutralización de tripsina y solución salina tamponada de Hanks)&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-41200</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11250</td><td></td></tr><tr><td>SIRP&alpha;-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>323807</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Construction</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.1% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-053-CI</td><td>Opcional: Para la recolección de células suplementarias de interés</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Paquetes PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, Bovino Tipo I</td><td>Life Technologies</td><td>A10644-01</td><td>Mantener en hielo</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águilas modificadas Medio (DMEM), alta glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Sodio HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte</td><td>><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0536757</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubo de centrífuga de polipropileno</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubo de fondo redondo de poliestireno</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Con 35 &mu integrados; M filtro de células</td></tr><tr><td>50 ml tubo de centrífuga de polipropileno</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos de fondo plano placa tratada para cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>raspador de células, desechable</td><td>Biologix</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Polisulfona</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Politetrafluoroetileno (teflón)</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dissecting Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>O similar, debe tener un soporte para que la cámara de alta velocidad se acople Sistema</td></tr><tr>de<td>estimulación eléctrica</td><td>Astro-Med, Inc</td><td>Grass S88X Estimulador</td><td></td></tr><tr><td>de Alta Velocidad Cámara</td><td>Pixelink</td><td>PL-B741U</td><td>O similar, pero debe ser capaz de 100 fotogramas por segundo para una adquisición de datos precisa</td></tr><tr><td>Control</td><td></td><td></td> de temperatura de la placa <td>Se utiliza para mantener la temperatura del medio durante la adquisición de datos.</td></tr><tr><td>Custom Materials</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>LabView Programa</td><td></td><td></td> de seguimiento <td>posterior disponible a petición de los autores</td></tr></tbody></table>

construcción de engineered definido humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

La ingeniería de tejidos cardíacos humanos puede tener un impacto fundamental en el descubrimiento terapéutico mediante el desarrollo de nuevos sistemas de cribado específicos de especies que replican la biofidelidad del miocardio humano nativo tridimensional, al tiempo que permiten un nivel controlado de complejidad biológica y permiten una monitorización longitudinal no destructiva de la función contráctil de los tejidos. Inicialmente, los tejidos cardíacos de ingeniería humana (hECT) se crearon utilizando toda la población celular obtenida de la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas, que normalmente producían menos del 50% de los cardiomiocitos. Sin embargo, para crear modelos predictivos fiables del miocardio humano y dilucidar los mecanismos de interacción heterocelular, es esencial controlar con precisión la composición biológica de los tejidos modificados. 
Para abordar esta limitación, utilizamos la clasificación de células vivas para el marcador de superficie cardíaca SIRPα y el marcador de fibroblastos CD90 para crear tejidos que contienen una proporción de 3:1 de estos tipos de células, respectivamente, que luego se mezclan y se agregan a una solución de matriz a base de colágeno. Por lo tanto, los TEC resultantes están completamente definidos tanto en su composición celular como en la de la matriz extracelular.
Aquí describimos la construcción de hECTs definidas como un sistema modelo para entender los mecanismos de las interacciones célula-célula en terapias celulares, utilizando un ejemplo de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hMSC) que se están utilizando actualmente en ensayos clínicos en humanos. La composición tisular definida es imprescindible para comprender cómo las hMSC pueden estar interactuando con los tipos de células cardíacas endógenas para mejorar la función tisular. También se describe un sistema de biorreactor que cultiva simultáneamente seis hECTs en paralelo, lo que permite un uso más eficiente de las células después de la clasificación.

Para obtener los miocitos cardíacos, una versión ligeramente modificada de los métodos de diferenciación Boheler y Lian se utiliza 30,31. Es imperativo que la diferenciación se inicia durante el registro de la fase de crecimiento celular, sino también que la población inicial es suficientemente confluente para obtener un número utilizable de las células después de la clasificación (aproximadamente 75% es óptimo). Típicamente, para H7 hESCs, placas a una densidad de 140.000 hESCs por pocillo de una placa de 6 ...

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

El objetivo general de este procedimiento es crear tejidos cardíacos humanos ingenierizados con una composición celular definida. Este método puede abordar desafíos clave en el campo de la ingeniería de tejidos cardíacos, incluyendo el control de la variabilidad y de las eficiencias de diferenciación cardíaca, así como comprender cómo tipos celulares específicos afectan la función contráctil cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que el resultado final es un tejido cardíaco humano ingenierizado con una composición controlada y definida.Las réplicas de esta técnica se extienden hacia la terapia para enfermedades cardíacas porque los tejidos definidos pueden proporcionar una plataforma novedosa, biológicamente relevante y de cribado biomédico capaz de evaluar intervenciones terapéuticas. Aunque este método puede ofrecer información sobre nuevos fármacos cardiovasculares, el sistema de tejido cardíaco ingenierizado humano también puede utilizarse para comprender los mecanismos de la terapia celular cardíaca. Comenzando con cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas, lave las células una vez con PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA al 0,04 %.Incube las células durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5%CO2. Mientras las células están en incubación, agregue 12 microlitros de inhibidor de ROCK a seis mililitros de solución de neutralización de tripsina. Retire las placas del incubador y agregue un mililitro de la solución de neutralización a cada pocillo de la placa de seis pocillos.Transfiera todas las células de cada pocillo a un solo tubo cónico de 15 mililitros. Lave los seis pocillos con un volumen de tres mililitros de PBS y combine este lavado con las células en el tubo. Centrifugue el tubo a 300 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para formar el pellet celular.Para preparar las células para la clasificación de células vivas mediante FACS, prepare el tampón de tinción añadiendo cinco mililitros de FBS y 50 microlitros de inhibidor ROCK a 45 mililitros de PBS en hielo. Retire el sobrenadante de las células sedimentadas y resuspenda estas en 1,2 mililitros de tampón de tinción. Transfiera 200 microlitros de las células en suspensión a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros previamente enfriado, sobre hielo.A continuación, transfiera el mililitro restante de la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros previamente enfriado sobre hielo y agregue dos microlitros de anticuerpos SIRP alfa-PE/Cy7 y cuatro microlitros de anticuerpos CD90-FITC. Mezcle suavemente la suspensión celular con una pipeta de transferencia y coloque el tubo sobre hielo. Incube los dos tubos de 50 mililitros que contienen el control negativo y la muestra en un agitador rotatorio sobre hielo a cuatro grados Celsius durante una hora.Mientras las células están en incubación, transfiera tres mililitros de medio de diferenciación 2 a cada uno de dos tubos cónicos de 15 mililitros. Luego agregue tres microlitros de inhibidor de ROCK y almacene estos tubos de recolección para FACS en hielo antes de su uso. A continuación, haga un pellet de las células teñidas a 300 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Y lávese dos veces con 10 mililitros de PBS frío con hielo. Suspender suavemente el sedimento de la muestra con uno a tres mililitros de tampón de tinción que contenga DAPI. Añadir 500 microlitros de tampón de tinción sin DAPI al sedimento del control negativo.Filtre ambas suspensiones celulares a través de un tamiz celular de 40 micrones para eliminar los agregados celulares, y luego transfiéralas a tubos de FACS de poliestireno sobre hielo. Lleve inmediatamente las muestras al clasificador celular. Comenzando con la muestra de control de tinción negativa, establezca los parámetros de selección.Luego, durante el análisis de las células de la muestra, seleccione la población de células viables DAPI negativas. Recopile independientemente las poblaciones de células positivas para FITC y positivas para PE/Cy7 a 20 PSI. Después de cultivar y reagregar las células, como se indica en el protocolo escrito, retire las placas de cultivo celular del incubador y transfiera el medio a un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros.Lave las placas con tres mililitros de PBS y transfiera el lavado al mismo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,04 % a las placas e incube a 37 grados Celsius y 5 % CO2. Después de cinco minutos, examine las placas para verificar la desprendimiento celular utilizando un microscopio.Una vez que todas las células se hayan desprendido, agregue tres mililitros de solución de neutralización de tripsina a las placas. Mezcle suavemente y transfiera las células al tubo original de centrífuga de 50 mililitros. Lave las placas con cinco mililitros de PBS y agregue este lavado al tubo también.Centrifugar las células a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para formar el sedimento. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un mililitro de suero bovino neonatal, o medio NBS. A continuación, transferir las células a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.Centrifugar las células a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Para comenzar la generación de los seis tejidos cardíacos modificados, diluir 60,0 microlitros del stock de colágeno al cinco miligramos por mililitro a 3,125 miligramos por mililitro con 1,5 microlitros de hidróxido de sodio uno molar, 9,6 microlitros de PBS 10X y 24,9 microlitros de agua estéril ultra pura. Aquí, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla de colágeno, ya que las burbujas de aire tardan en liberarse de la solución viscosa y pueden interferir con la formación del tejido durante la compactación del tejido.Pipetee por la pared del tubo de 15 mililitros para agregar 12,0 microlitros de cada uno de MEM 10X y 0,2 normales de heaps a pH 9 para diluir la mezcla de colágeno. A continuación, agregue la matriz de la membrana basal a la mezcla de colágeno hasta una concentración final de 0,9 miligramos por mililitro y mezcle suavemente. Almacene esta mezcla tisular final en hielo.A continuación, transfiera toda la mezcla de tejido al pellet celular y agregue las células suplementarias según se indica en el protocolo del texto. Complete el tubo hasta un volumen final de 150 microlitros con medio NBS libre de células y mezcle suavemente. Pipete cuidadosamente 25 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los seis pozos de la placa base del biorreactor.Repita el procedimiento de mezcla entre cada pocillo para resuspender cualquier célula que pueda haberse sedimentado. Pipetee solo un tejido por pocillo a la vez para asegurar un volumen y número de células consistentes por tejido. Por separado, inserte dos filas de sensores de fuerza de polidimetilsiloxano, o PDMS, en ambos lados del marco de polisulfona para formar seis pares de postes opuestos.Voltee el marco sobre la placa base de manera que un par de postes entre en cada pocillo que contiene la suspensión celular. Luego, coloque el biorreactor en un recipiente de 60 milímetros y coloque ese recipiente sin su tapa dentro de un recipiente de 10 centímetros. Coloque la tapa sobre el recipiente de 10 centímetros y traslade todo el conjunto del biorreactor al incubador de cultivo celular.Después de dos horas de incubación, retire el conjunto del biorreactor y agregue 14 mililitros de medio NBS para cubrir la placa base. Devuelva el biorreactor al incubador de cultivo celular y cambie la mitad del medio cada día. Después de 48 horas, retire suavemente la placa base unos pocos milímetros a la vez.Luego, devuelva el biorreactor con el tejido hacia abajo al medio. Si un tejido se desprende de un poste al retirar la placa base, vuelva a colocar suavemente el tejido sobre el poste. La diferenciación de células madre embrionarias humanas da como resultado un cultivo mixto compuesto principalmente por cardiomiocitos y fibroblastos que se autoorganizan en grupos y forman redes de contracción robusta a lo largo de la placa.La clasificación mediante FACS de estos cultivos reveló que este método de diferenciación da como resultado una población que contiene al menos un 65% de células positivas para SIRP alpha y un 10% de células positivas para CD90. Después de retirar la placa base, se permite que los tejidos cardíacos humanos ingenierizados, o HECTs, se autoensamblen dentro del biorreactor. Los HECTs maduros y compactados desvían visiblemente los postes integrados de detección de fuerza con una fuerza promedio de cinco a 15 micronewtons.Las mediciones de la fuerza de contracción revelan cómo variables aisladas alteran la fuerza contráctil en estos tejidos ingenierizados definidos. Aquí, cuando los tejidos se suplementan con un 10% de células madre mesenquimales humanas, se observa un aumento sustancial de la fuerza contráctil tanto a frecuencias de estimulación de un hercio como de dos hercios. Una vez dominado, el proceso de diferenciación tomará aproximadamente 20 días, la clasificación celular unas cinco horas y la construcción del tejido unas tres horas.Se requerirán otros siete días para la formación adecuada del tejido después de la construcción. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluyendo la marcación celular y la suplementación de la mezcla de tejido, con el fin de responder preguntas adicionales sobre los efectos de interacciones celulares específicas o para determinar los mecanismos de la terapia celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear tejidos cardíacos humanos ingenierizados con una composición celular conocida y controlada.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Aquí, se muestra la generación de tejido del corazón ingeniería humana a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) derivada de los cardiomiocitos. Se presenta un método para analizar la fuerza de contracción y la alteración ejemplar de patrón de contracción por el hERG inhibidor del canal E-4031. Este método muestra alto nivel de robustez y la idoneidad para la detección de drogas cardíaco.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Este protocolo tiene como objetivo fabricar esferoides cardíacos 3D (CS) mediante el co-cultivo de células en gotas colgantes. Los CS incrustados en colágeno se tratan con doxorubicina (DOX, un agente cardiotóxico) a concentraciones fisiológicas para modelar la insuficiencia cardíaca. Las pruebas in vitro con CS tratadas con DOX se pueden utilizar para identificar nuevas terapias para pacientes con insuficiencia cardíaca.

Esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Aquí se presenta un conjunto de protocolos para la generación y criopreservación de esferoides cardíacos (CS) a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos cultivados en un formato multidimensional de alto rendimiento. Este modelo tridimensional funciona como una plataforma robusta para el modelado de enfermedades, exámenes de detección de alto rendimiento y mantiene su funcionalidad después de la criopreservación.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprende a construir tejidos cardíacos humanos definidos mediante marcadores de superficie y FACS para estudiar mecanismos de terapia celular cardíaca. Este método proporciona un modelo funcional controlado.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

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