Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

El objetivo del siguiente experimento es generar tejido miocárdico funcional alineado mediante impresión por microcontacto. Esto se logra mediante la impresión de fibronectina por primer microcontacto sobre sustratos de polidimetilsiloxano. Como segundo paso, doble transgénico.

Las líneas de células madre embrionarias se diferencian in vitro y se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia, lo que permite obtener poblaciones altamente purificadas de progenitores fuertemente cardiogénicos. A continuación, los progenitores cardíacos aislados se siembran en sustratos de PDMS micropatentados para hacerlos malignos y adoptar una forma de bastón similar a la de un miocito cardíaco. Se obtienen resultados que muestran el aislamiento exitoso y un crecimiento isotrópico de progenitores cardíacos basados en hechos y análisis de inmunofluorescencia.

La generación de un tejido miocárdico isotrópico puede ayudar a avanzar en los campos de la biología de células madre y la bioingeniería de tejidos, al aumentar la posibilidad de desarrollar células específicas de la enfermedad para el desarrollo y descubrimiento de fármacos. Y sentando las bases de la medicina regenerativa cardíaca. Primer protector IL, elastómero de polidimetil alano 180 4 en una proporción de agente de acusión basada en 10 a uno y mezcle bien.

Desgasifique el conjunto con un desecador para eliminar las burbujas de aire. Vierta el PDMS en un maestro previamente fabricado con crestas de herramientas de 20 micras de ancho y dos micras separadas por un espaciado de 20 micras, luego cure durante dos días en un desecado a temperatura ambiente para obtener sellos de PDMS micro texturizados. Después de renderizar las superficies del sello PDMS, hidrófilo con un limpiador de plasma.

Esterilizar los sellos con etanol al 70% durante un minuto. En una cabina de seguridad biológica, seque rápidamente con aire comprimido. Cubra las superficies estériles de los sellos con una solución de fibronectina para que se absorba durante al menos 10 minutos después de la absorción.

Sacuda la solución de fibronectina de los sellos y seque rápidamente con aire comprimido. Establezca un contacto conforme entre el sello y los cubreobjetos de vidrio recubierto de PDMS previamente preparados, como se describe en el protocolo de texto, durante dos minutos y presione firmemente. Enjuague los sustratos de micropatrones con agua destilada.

Guárdelos en agua destilada durante un máximo de dos semanas de cuatro grados centígrados, a menos que se vayan a usar de inmediato. Cubra seis placas de pocillos con gelatina estéril al 0,1% en agua destilada y deje que se absorba durante 15 minutos a 37 grados centígrados Durante este tiempo, prepare los fibroblastos embrionarios de ratón a partir de ahor alícuota agregándolos a 50 mililitros de PBS en un tubo cónico. Centrifuga la metanfetamina a 1000 RPM durante cinco minutos y vuelve a suspenderla en medio de metanfetamina.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspirar el exceso de gelatina y añadir el mes en los pocillos. Espere un día para que el MES se conecte. Prepare las células madre embrionarias o células madre embrionarias a partir de una alícuota de pensamiento agregándolas a 50 mililitros de PBS en una centrífuga de tubo cónico.

Las celdas ES 1000 RPM durante cinco minutos y Resus las suspende en medio ESC. Añadir las células E ES a los pocillos que contienen mitos y mantener en medio ESC hasta alcanzar la confluencia para masajear las células ES cofluentes. Primero aspire el medio ESC y lave las células una vez con PBS estéril.

Luego aspire el PBS y agregue 500 microlitros de viajes en el pozo. Incubar la placa durante tres minutos y medio a 37 grados centígrados. Pipetear la solución TRIPSIN hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Primero en descomponer las colonias de células E es. A continuación, neutralice la solución de tripsina añadiendo 500 microlitros de medio ESC al pocillo. Masajee las células madre embrionarias de acuerdo con la proporción requerida, aquí las células madre embrionarias se pasan en una proporción de uno a 30, lo que les permite alcanzar la confluencia en tres días.

Comienza la diferenciación in vitro cuando las células madre embrionarias han alcanzado la confluencia. Primero cubra placas de cultivo de 10 centímetros con gelatina estéril al 0,1% en agua destilada y déjela absorber durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Durante este tiempo, coseche las células madre embrionarias como antes.

Una vez transcurridos los 15 minutos, aspire el exceso de gelatina y añada aproximadamente de un tercio a la mitad de la suspensión de células E ES en placas cultivadas que contengan medio de adaptación. Después de cultivar las células en medio de adaptación durante dos días, recoja las células madre embrionarias adaptadas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga PBS utilizando 1,5 mililitros de tripsina. Centrifugarlos a 1000 RPM durante cinco minutos y volver a suspenderlos en medio de diferenciación.

Hacer cuerpos embrionarios o EBS de aproximadamente 1000 células por gota de 10 microlitros de medio de diferenciación en placas de cultivo de 15 centímetros. Con una pipeta multicanal, invierta las placas y el cultivo. EBS está colgando gotas durante dos días y medio a 37 grados centígrados.

Después de dos días y medio, extraiga el EBS de seis a ocho placas de 15 centímetros en una utilizando un medio de diferenciación y cultívelas durante otros tres días y medio. Después de otros tres días y medio, recoja el EBS en un tubo cónico de 50 mililitros y lave la placa una vez con PBS estéril para recoger todo el ebs. Luego déjalos hundir hasta el fondo durante aproximadamente cinco minutos.

A continuación, retire el supinato y lave el EBS con PBS estéril. Deje que el EBS se hunda hasta el fondo nuevamente durante aproximadamente cinco minutos. Disociar el EBS añadiendo 2,5 mililitros de tripsina y agitar suavemente el tubo al baño maría a 37 grados centígrados durante dos minutos.

A continuación, añada 2,5 mililitros de PBS estéril a la solución de tripsina y pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta serológica de 10 mililitros aproximadamente de ocho a 10 veces para descomponer los grupos de células. Neutralice la tripsina con 10 mililitros de tampón de fax que contenga 7,5 % de célula ES E o FBS de grado de diferenciación y 0,01 % DPI en centrífuga PBS, EBS disociado a 1000 RPM durante cinco minutos. A continuación, retire el supinato y añada aproximadamente un mililitro de pipeta tampón de fax hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro aproximadamente de ocho a 10 veces para descomponer los grupos de células.

Transfiera las células a un tubo de fondo redondo estéril con un filtro de células de 35 micras para obtener una suspensión de una sola célula. Clasifique las células madre embrionarias diferenciadas utilizando un citómetro de flujo aria y obtenga poblaciones purificadas de progenitores ventriculares comprometidos. Consulte la parte de texto del protocolo para obtener información detallada sobre la estrategia de compuertas.

Comió los sustratos de micro patrones con 1%onic F1 27 en agua destilada durante 10 minutos. A continuación, lávelos tres veces con PBS estéril. Coloque las juntas de PDMS alrededor de la región del patrón y presione firmemente.

A continuación, siembre los progenitores cardíacos en sustratos de micropatrones de fibronectina. Las siguientes imágenes son de un gráfico representativo de citometría de flujo de células madre embrionarias diferenciadas in vitro del sexto día. Esta imagen muestra la compuerta en la amplitud de dispersión directa FSCA y la amplitud de dispersión lateral SSCA.

Esto permite la separación de células enteras de los desechos celulares. Aquí se ve la compuerta en FSCA y el ancho de dispersión hacia adelante FSCW. Esto permite el aislamiento de singletes celulares de dobletes y otros agregados celulares.

Esta imagen muestra la compuerta en SSCA y la dispersión con SSCW. Esto aumenta la pureza de los singletes celulares. Esta imagen muestra la compuerta en la tinción de FSCA y DPI que permite el aislamiento de células DPI negativas viables de células no viables.

Aquí se ve la compuerta para fico, rine, PE y PE cian en DI siete PE SI siete. Esto permite obtener glóbulos rojos verdaderos positivos y rojos verdaderos negativos y excluir los glóbulos rojos negativos autofluorescentes. Estas imágenes muestran la compuerta para el ajuste de la amplitud del isotiocianato de fluoresceína CA y PEA que permite clasificar las células verdes verdaderas positivas y verdes verdaderas negativas dentro de las poblaciones de rojo positivo y rojo negativo.

La purificación por fax de células madre embrionarias diferenciadas in vitro revela cuatro poblaciones distintas de progenitores, como se ve en este gráfico de citometría de flujo. Las cuatro poblaciones distintas de progenitores son rojo, verde positivo, rojo positivo, verde positivo, rojo negativo, verde negativo positivo y rojo negativo verde negativo. Esta imagen representativa de microscopía de inmunofluorescencia muestra sustratos de fibronectina con micropatrones.

La barra de escala representa 80 micras. Esta imagen muestra microscopía de inmunofluorescencia representativa de hechos derivados embrionarios, progenitores aislados en los paneles superiores y hechos derivados de ESL, progenitores aislados en los paneles inferiores después de cinco días adicionales de cultivo en núcleos de micropatrones de fibronectina teñidos de azul. La alfa actinina sarcomérica teñida de rojo S-M-M-H-C-A aparece de color verde.

La barra de escala es de 40 micras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar tejido miocárdico funcional anisotrópico a partir de una fuente celular renovable de proto cardíaco.