Name: Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a generar tejido miocárdico funcional alineado mediante impresión por microcontacto usando progenitores cardíacos derivados de células madre embrionarias. Este método avanza en ingeniería de tejidos cardíacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo se llevó a cabo, en parte, en el Centro de Sistemas de nanoescala (SNC), miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura (NNIN), que es apoyada por la National Science Foundation NSF con la beca no. ECS-0.335.765. CNS es parte de la Universidad de Harvard.

El protocolo para generar alineado tejido miocárdico funcional se puede dividir en tres partes principales. La fabricación del maestro micropatterned utilizando técnicas litográficas blandas no se considera parte de la siguiente protocolo pero se puede hacer basado en el método establecido 6. 1. Microcontacto impresión de fibronectina en PDMS Sustratos <ol><li> Mezclar Sylgard 184 (Dow Corning) elastómero PDMS en una base de relación de 10:1 a curar agente y desgasificar el conjunto utilizando un desecador para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Curar PDMS contra un maestro previamente fabricado con 20 micras de ancho y 2 crestas altas mu m, separadas por espaciamiento 20 micras, ya sea para 2 días a temperatura ambiente o 4 hr a 65 ° C para obtener Microtexturados Sellos de PDMS. </li></ol> * El curado en un desecador es muy recomendable para eliminar las burbujas de aire. <ol start="3"><li> Girar capa PDMS sobre cubreobjetos de vidrio (por ejemplo,22x22 mm) a 5.000 rpm durante 2 min utilizando una recubridora de rotación Avanza para producir fina y uniforme PDMS sustratos de espesor 15 micras. </li><li> Limpie sellos con etanol al 70% para eliminar el polvo y las partículas de suciedad. Deje secar al aire. </li></ol> Sellos * Puede ser utilizado en varias ocasiones, sin embargo, la renovación de sellos de PDMS sobre una base regular es recomendado debido a una abrasión en la superficie con el tiempo. <ol start="5"><li> Sellos de lugar en un limpiador de plasma SPI-Prep II de plasma y un proceso para 1 min a 275 mTorr para hacer superficies de PDMS hidrófilo. </li></ol> * El oxígeno tratamiento de plasma deben ser observados. Los tiempos más largos de tratamiento puede dar lugar a la formación de grietas del elastómero. <ol start="6"><li> Sellos de esterilizar con 70% de etanol durante 1 min. Secar rápidamente con aire comprimido. </li></ol> * Otros pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad. <ol start="7"><li> Cubra las superficies de sello con Fibronectin solución (50 mg / ml en ddH 2 O). Dejar que se adsorben al menos 10 min. </li><li> Sacuda solución de fibronectina sellos y se secan rápidamente con el aire comprimido. </li><li> Establecer contacto conforme entre sellos y sustratos PDMS durante 2 minutos y presione firmemente. </li><li> Enjuague con sustratos micropatterned ddH 2 O. Guárdelos en ddH 2 O para un máximo de 2 semanas a 4 ° C, a menos inicialmente utilizado. Tienda PDMS sellos en ddH 2 O. </li></ol> 2. Mantenimiento de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias Primero, prepare los siguientes medios para el cultivo de células madre embrionarias de ratón: Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)-Medio: Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS) de células ES-o diferenciación de grado, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) Células madre embrionarias (ESC)-Medio: DMEM, 15% FBS células ES-grado,1% no aminoácidos esenciales (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,0007% de 2-mercaptoetanol (2-ME) <ol><li> Capa 6-y las placas con gelatina estéril al 0,1% en ddH 2 O y se deja absorber 15 min a 37 ° C. </li><li> Añadir MEFs de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender en MEFs MEF-medio plazo. </li><li> Después de la adsorción, aspirado exceso de gelatina y MEFs complemento en los pocillos. Permitir MEFs 1 día a adjuntar. </li></ol> * Una alícuota de 10 millones de MEFs suficiente para 3 placas de 6 pocillos. <ol start="4"><li> Cuando MEFs han unido, añadir las células ES a partir de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender las células madre embrionarias en ESC-medio y agregar a los pocillos que contienen MEFs. Las células madre embrionarias en cultivo ESC-medio hasta que se alcanza la confluencia. </li></ol> * Una vez que las células madre embrionarias han alcanzado la confluencia, los pases se required para evitar el crecimiento excesivo y mantener colonias de células ES. <ol start="5"><li> Preparar las células madre embrionarias para pasajes. Aspirar ESC-medio y lavar una vez con PBS estéril. </li><li> Aspirar el PBS y se añaden 500 l de tripsina. Proceso de 3,5 min a 37 ° C. </li><li> Vierta la solución Tripsina arriba y abajo varias veces para romper las colonias de células ES y neutralizarla con 500 l de ESC-medio. </li><li> Passage células ES de acuerdo a su proporción deseada, por ejemplo, transferencia 33 l a otra así preparada previamente con MEFs paso a 1/30. Mantener las células madre embrionarias en ESC-Media. </li></ol> * Una relación de paso de 1/30 permite que las células ES para la confluencia en 3 días. Las células madre embrionarias Pasaje de acuerdo a su horario de diferenciación in vitro. 3. Diferenciación in vitro de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias y el aislamiento y siembra de células progenitoras cardíacas En primer lugar, preparar el followimedios ng necesario para la diferenciación in vitro de células ES: Adaptación-Medio: medio modificado de Dulbecco Iscove (IMDM), 15% FBS células ES de grado, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% de 2-ME Diferenciación-Medio: IMDM, el 15% de SFB Diferenciación grado. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% de ácido ascórbico 0,1 M, 0,0007% de 2-ME <ol><li> Iniciar la diferenciación in vitro cuando las células ES han llegado a la confluencia. Escudo 10 cm de platos de cultivo estéril con 0,1% de gelatina en ddH 2 O y se deja adsorber 15 min a 37 ° C. </li></ol> * Tenga en cuenta la duración del proceso de diferenciación in vitro en. Se tarda 8 días hasta progenitoras cardíacas pueden ser aislados. Planifique sus experimentos en consecuencia. <ol start="2"><li> Cosecha de células madre embrionarias como antes. Después de la adsorción, el exceso de aspirado de gelatina y añadir aproximadamente 1.3 a 1.2 de la suspensión de células ES para cultivo preparadoplatos que contienen Adaptación y medio plazo. Células de cultivo durante 2 días. </li></ol> * Seleccione la cantidad de células madre embrionarias para la adaptación de acuerdo a sus experimentos. <ol start="3"><li> Cosecha adaptado células ES en un tubo cónico de 50 ml que contenía PBS utilizando 1. 5 ml de tripsina. Centrifugar las células disociadas ES a 1.000 rpm durante 5 min y se resuspenden en ellos Diferenciación-medio. </li><li> Hacer cuerpos embrioides (EB) de aproximadamente 1.000 células por 10 l gota en 15 cm de platos de cultivo usando una pipeta multicanal. Invertir las placas y EBS cultura como colgar gotitas durante 2,5 días a 37 ° C. </li><li> Después de 2,5 días, la piscina de EBs de 6-8 15 cm de platos de cultivo en un medio de diferenciación por medio-y cultivarlos durante otros 3,5 días a 37 ° C. </li><li> Después de 3,5 días, recoger embrioides en un tubo cónico de 50 ml y dejar que se hunden al fondo durante aproximadamente 5 min. Aspirar el sobrenadante y lavar EBS con PBS estéril. Vamos EBS hundirse de nuevo a la parte inferior de aproxoximately 5 min. </li><li> Disociar EBS mediante el procesamiento de ellos con 2. 5 ml de tripsina durante 2 min en un baño de agua a 37 ° C agitando suavemente el tubo. A continuación, agregue 2. 5 ml de PBS estéril a la solución de tripsina y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml serológica aproximadamente 8-10 veces para romper los grupos de células. Neutralizar la tripsina con 10 ml de tampón FACS que contenía 7,5% de FBS células ES o diferenciación de grado y 0,01% en PBS DAPI. </li><li> Centrifugar disociado de EBs a 1.000 rpm durante 5 min y resuspender ellos en aproximadamente 1 ml de tampón FACS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml aproximadamente 8-10 veces para romper grupos de células. </li></ol> * Añadir tampón FACS de acuerdo con la cantidad estimada de disociar EBS. Células demasiado concentrados pueden obstruir durante FACS y células concentradas demasiado bajas pueden prolongar el tiempo de FACS innecesariamente. <ol start="9"><li> Transferir las células a un recipiente estéril de fondo redondo de tubo con un filtro de células 35 micras para obteneruna suspensión de células individuales. </li><li> Clasificar las células diferenciadas ES utilizando un citómetro de flujo FACSAria y obtener poblaciones purificadas de CVP. </li></ol> * Se desarrolló una estrategia de puerta de varios pasos para aislar células altamente purificadas de colores. En resumen, primera puerta a la amplitud dispersión frontal (FSC-A) y la amplitud de dispersión lateral (SSC-A) (fig. 1A). Esto nos permite separar las células enteras a partir de los desechos celulares. A continuación, en la puerta de FSC-A y Forward Scatter-Ancho (FSC-W) (fig. 1B). Esto nos permite aislar células singletes de dobletes y otros agregados celulares. A continuación, en la puerta SSC-A y Side Scatter-Ancho (SSC-W) (Figura 1 C). Esto aumenta la pureza de singletes de células. A continuación, la puerta en la tinción DAPI para aislar células viables (DAPI-negativa) a partir de células no viables (Figura 1D). A continuación, la puerta en Phycoeryhthrin Amplitud (PE-A) y PE-colorante de cianina 7 Amplitud (PE-Cy7-A) para obtener cierto rojo-positivo (R + </sup&gt;) y verdaderos negativos en rojo (R - células) y para excluir autofluorescentes rojo-negativos células (Figura 1E). R + y R - células son luego cerrada por separado en amplitud con isotiocianato de fluoresceína (FITC-A) y PE-A para ordenar verdaderos verde-negativas (G -)-positivos verde (G +) y cierto células dentro de estas poblaciones (Figura 1F + 1G). Esto resulta en 4 poblaciones de células como sigue: R + G +, R + G -, R - G + y R - G - (Figura 1H). <ol start="11"><li> Pasivar micropatterned sustratos con 1% de Pluronic F-127 en ddH 2 O durante 10 min. Entonces, lávelos 3 veces con PBS estéril. </li></ol> * Pluronic F-127 es un tensioactivo que bloquea la adhesión celular. Es compatible con el confinamiento de la adhesión celular a la superficie microestructurada. <ol start="12"><li> Coloque juntas PDMS alrededor de la región modeladay presione firmemente. Entonces, las semillas de CVP en fibronectina sustratos micropatterned. </li></ol>

<ol><li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
<li>Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiogenesis+and+the+complex+biology+of+regenerative+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine.</a> Science. 322, 1494-1497 (2008).</li>
<li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326, 426-429 (2009).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).</li>
<li>Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+aspects+of+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological aspects of cardiac tissue engineering.</a> Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+regulates+collagen+type+I+expression+in+human+tendon+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).</li>
<li>Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+microtextured+scaffold+templates+to+control+organization+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).</li>
<li>Isenberg, B. C., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+structure+into+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Building structure into engineered tissues.</a> Materials Today. 9, 54-60 (2006).</li>
<li>Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+biomechanics+in+tissue+engineering+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+contractile+strength+of+engineered+cardiac+muscle+by+hierarchal+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture.</a> Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).</li>
<li>Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).</li>
<li>Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+approach+to+micropattern+cells+on+common+culture+substrates+by+tuning+substrate+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability.</a> Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).</li>
<li>Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+postnatal+growth+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Characterisation of postnatal growth of the murine heart.</a> Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).</li>
<li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+pathologic+cardiac+hypertrophy+in+adulthood+is+preceded+by+neonatal+cardiac+growth+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Ohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+of+the+transverse-axial+tubule+system+in+ventricular+cardiomyocytes+from+failing+and+non-failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts.</a> Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373(2009).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+cell+sheets+for+constructing+three-dimensional+tissue+with+well-organized+cell+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation.</a> Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).</li>
<li>Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+of+aligned+cell+sheets+for+layer-by-layer+control+of+complex+tissue+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure.</a> Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

En este protocolo, hemos presentado un método para aislar poblaciones purificadas de células progenitoras cardiogénico y sembrar en ellos micropatterned sustratos fibronectina lo que les permite alinear y dar un miocito cardíaco-como forma de bastón. Organización celular normal es crítica para la función del tejido normal de 8,10, en particular para el tejido miocárdico. Los miocitos cardíacos se ha demostrado que desarrollar mecánica mejorada y propiedades electrofisiológicas 11,12 11,13 al formar...

A pesar de los recientes avances en el tratamiento médico, la insuficiencia cardíaca avanzada sigue siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en los países desarrollados. El síndrome clínico surge de una pérdida de tejido funcional del miocardio y, posteriormente, la incapacidad del corazón insuficiente para satisfacer las demandas metabólicas de los individuos afectados. Puesto que el corazón tiene una capacidad regenerativa limitada, el trasplante autólogo de corazón es el único tratamiento actual clínicamente aceptado directamente dirigidas a la reposición de tejido perdido corazón funcional. Inconvenientes significativos de trasplante de corazón, incluyendo un número limitado de corazones de donantes y la necesidad de que a largo plazo la terapia inmunosupresora, impide el uso generalizado de esta terapia. Como resultado, la terapia médica ha sido el pilar del tratamiento para los pacientes con enfermedades del corazón. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que precisa recapitular fisiología del miocardio normal y enfermo in vitro. <html> La convergencia reciente de la biología de células madre y la tecnología de la ingeniería de tejidos plantea nuevas vías prometedoras para la regeneración cardiaca. Generación de tejido miocárdico funcional de un renovable específica del paciente fuente, sería un avance importante en el campo. Esto permitiría el desarrollo de enfermedades específicas ensayos celulares para el desarrollo y descubrimiento de fármacos y podría establecer las bases para la medicina regenerativa cardíaca. Humanos madre embrionarias (ES) de células y, significativamente más, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) representan una potencialmente renovable específica del paciente fuente de células progenitoras y los miocitos ventriculares maduros ventriculares. La combinación de la biología de células madre y la ingeniería de tejidos aborda este problema mediante la generación de tejido cardiaco funcional in vitro que se pueden utilizar en el desarrollo de ensayos celulares para el descubrimiento de medicamentos o en cardíacos enfoques regenerativos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca avanzada. _content &quot;&gt; Un reto fundamental en la regeneración cardiaca ha sido la identificación de un tipo celular óptimo. Una amplia variedad de células han sido estudiados 1, sin embargo hasta la fecha, a pesar de diferentes precursores multipotenciales cardiogénicas de diversas fuentes han sido descubiertos, la identificación de una célula fuente que cumpla con los requisitos críticos tales como el compromiso con el destino de la célula miogénica, el mantenimiento de la capacidad de expandir in vivo o in vitro y la composición a un tejido miocárdico funcional ha demostrado ser un problema central 2. Hemos descrito previamente un doble sistema murino transgénico que permite el aislamiento de poblaciones altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventriculares (CVP) de la diferenciación de células ES in vitro. Hemos generado un nuevo ratón doble transgénico que expresa la proteína fluorescente roja DsRed bajo el control de un potenciador dependiente de ISL1 del gen y MEF2C el aumento de proteína verde fluorescente bajo el control deel específico del corazón Nkx2.5 potenciador. Sobre la base de este sistema reportero fluorescente de dos colores, progenitores corazón primero y segundo de campo de las células ES en desarrollo pueden ser aislados por medio de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con su expresión de genes y MEF2C Nkx2.5. CVP se asemejan a los miocitos cardíacos basados ​​en los patrones de expresión de marcadores miocárdicos y cualidades estructurales y funcionales de 3, lo que ofrece una gran promesa para los propósitos de tejidos cardíacos regenerativas. Aunque ha habido muchos avances en el campo de la ingeniería de tejidos, imitando la arquitectura celular natal sigue siendo un desafío clave. Los métodos convencionales para hacer frente a este reto incluyen la siembra andamios biológicos o sintéticos con células in vitro. Debido a un número de desventajas de los andamios, incluyendo una rápida degradación, la estabilidad física y mecánica limitada y baja densidad celular 1,4,5, hemos intentado diseñar andamios menos tejido. AltHough células cardiacas pueden modificar su microentorno local por la secreción de proteínas de matriz extracelular, que tienen una capacidad más limitada para organizarse a la varilla miocitos cardiacos con forma en la ausencia de señales extracelulares. Por lo tanto, una plantilla que proporciona células apropiadas señales espaciales y biológicos para componer el tejido miocárdico funcional se requiere. La impresión por microcontacto aborda este reto proporcionando una técnica sencilla y barata para controlar con precisión la forma celular, la organización y función 6-8, todos los cuales son cruciales para la generación de alineado tejido miocárdico funcional. Comprende el uso de Microtexturados polidimetilsiloxano (PDMS) sellos con tamaños de las características que van a 2 micras 9 que permiten la deposición de proteínas de matriz extracelular sobre sustratos de PDMS en patrones precisos y por lo tanto afectar a la adhesión celular espacialmente. En este documento, se propone combinar la tecnología de bioingeniería de tejidos con tallo cell biología para generar anisotrópico tejido miocárdico funcional. En consecuencia, aquí demuestran nuestro enfoque publicado recientemente por el siguiente: (1) la generación de superficies de las proteínas microestructurada en PDMS sustratos por impresión por microcontacto para la generación de un modelo de tejido de miocardio alineados, (2) el aislamiento de alta pureza a partir de progenitores cardíacos diferenciación de células ES in vitro, y (3) la combinación de ambas técnicas para generar alineado tejido miocárdico funcional.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Preparar una solución 0,1 M en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Desecador de vacío de 10 pulgadas </td><td> Nova-Tech International, Inc. </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado Medio Eagle </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suero Bovino FetalDe células ES de grado </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Suero Fetal Bovino Diferenciación de grado </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectina de plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubilizar a 1 mg / ml en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest premium cubierta del cristal 22x22mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 a 548-B </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina de piel porcina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Preparar 0,1% de solución en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Avanza recubridora de rotación </td><td> Avanza la investigación, Inc. </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Medio modificado de Iscove Dulbecco </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Factor inhibidor de leucemia </td><td> Yo-Preparó a partir de líneas celulares secretoras de LIF- </td><td></td><td> Preparar una solución madre 500 veces </td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Los fibroblastos de embriones de ratón </td><td> Cosechado a partir de embriones de ratón 12-15 días </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Preparar solución al 1% en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Tubo de fondo redondo con 35 micras filtro de células </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner </td><td> SPI Supplies </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> SylgardKit de elastómero de silicona 184 </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum Gauge </td><td> SPI Supplies </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generación de tejido funcional del miocardio alineados través de la impresión por microcontacto

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

La insuficiencia cardíaca avanzada representa un importante desafío clínico insatisfecha, derivada de la pérdida de células musculares viables y / o funcional totalmente cardíacas. A pesar de la terapia óptima del fármaco, la insuficiencia cardiaca es una causa principal de mortalidad y morbilidad en el mundo desarrollado. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que recapitulan precisión normal y enfermo fisiología humana miocardio in vitro. Del mismo modo, los principales retos de la biología regenerativa cardíaca giran en torno a la identificación y el aislamiento de pacientes específicos de células progenitoras cardiacas en cantidades clínicamente relevantes. Estas células tienen que luego se ensamblan en tejido funcional que se asemeja a la arquitectura del tejido del corazón nativo. Impresión por microcontacto permite la creación de formas precisas que se asemejan a proteínas micropatterned organización estructural del corazón, proporcionando así señales geométricas para controlar la adhesión celular espacialmente. En estadescribimos nuestro enfoque para el aislamiento de las células del miocardio altamente purificada a partir de células madre pluripotentes de diferenciación in vitro, la generación de superficies de crecimiento de células micropatterned con proteínas de matriz extracelular, y el conjunto de las células madre derivadas de células del músculo cardiaco en el tejido de miocardio anisotrópico.

FACS-purificación de células in vitro ES diferenciadas reveló cuatro poblaciones distintas de células progenitoras (Figura 1). La presencia de fibronectina microestructurada se confirmó por microscopía de inmunofluorescencia que muestra una transferencia completa de líneas continuas de fibronectina (Figura 2). Revestimiento de FACS-progenitores aislados en micropatrones fibronectina resultó en la alineación de la R + G + y parte de la R -</su...

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

El objetivo del siguiente experimento es generar tejido miocárdico funcional alineado mediante impresión por contacto microscópico. Esto se logra primero imprimiendo fibronectina por contacto microscópico sobre sustratos de poli(dimetilsiloxano). Como segundo paso, doble transgénico.Las líneas de células madre embrionarias se diferencian in vitro y se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia, lo que permite obtener poblaciones altamente purificadas de progenitores fuertemente cardiogénicos. A continuación, los progenitores cardíacos aislados se siembran sobre sustratos micro patentes de PDMS para inducirlos a alinearse y adoptar una forma alargada similar a la del miocito cardíaco. Los resultados obtenidos muestran el aislamiento exitoso y el crecimiento anisotrópico de los progenitores cardíacos, basados en datos y análisis de inmunofluorescencia.Generar un tejido miocárdico isotrópico puede ayudar a avanzar en los campos de la biología de células madre y la bioingeniería de tejidos al plantear la posibilidad de desarrollar ensayos celulares específicos para enfermedades en el desarrollo y descubrimiento de fármacos, y al sentar las bases para la medicina r

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Este protocolo describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

Proporcionamos un protocolo generalizado basado en una estrategia de bioprinting de microfluidos para la ingeniería de un lecho vascular de microfibra, donde un tipo de célula secundaria podría ser más sembrado en el espacio intersticial de esta estructura de microfibra para generar organoides y tejidos vascularizados.

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprende a generar tejido miocárdico funcional alineado mediante impresión por microcontacto usando progenitores cardíacos derivados de células madre embrionarias. Este método avanza en ingeniería de tejidos cardíacos.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Explorar más videos