Secuenciación de amplicones utilizando las tecnologías de secuenciación de lectura larga

Investigo si la secuenciación portátil de lectura larga puede proporcionar resultados de susceptibilidad resistente a la tuberculosis en entornos con recursos limitados, con una precisión comparable al método de estándares de oro, avanzando en diagnósticos de tuberculosis accesibles y de alta calidad. Utilizar secuenciación dirigida de nueva generación como herramienta diagnóstica para la tuberculosis resistente a medicamentos, ofreciendo un perfil completo de resistencia directamente de la muestra clínica sin conocimientos en bioinformática. Nuestro protocolo, que utiliza secuenciación de lecturas largas, tiene el potencial de proporcionar tiempos de respuesta más rápidos, un flujo de trabajo más sencillo que en la detección de resistencia en tiempo real, facilitando diagnósticos completos de TB y mejorando el seguimiento de brotes en entornos con recursos limitados y una infraestructura mínima.

Para empezar, calcula 100 nanogramos de cada muestra de amplicón en función de la concentración y transfiere el volumen requerido a un tubo PCR limpio. Para determinar la masa total de amplicones en la muestra, se utiliza la fórmula dada. Ajusta el volumen total de cada muestra a 12,5 microlitros usando agua libre de nucleasa.

Mezcla las muestras suavemente pipeteando arriba y abajo 10 veces y hazlas girar brevemente en una microcentrífuga. A continuación, añade 1,75 microlitros de tampón de reparación final y reacción de adenilación a cada muestra, seguido de 0,75 microlitros de mezcla enzimática de reparación final y adenilación. Después de mezclar y centrifugar las muestras, coloca los tubos en un termociclador a 25 grados Celsius durante 30 minutos, seguido de 65 grados Celsius durante 30 minutos.

Para la ligación nativa de códigos de barras, añade los componentes que aparecen en la pantalla en nuevos tubos de PCR. Mezcla las reacciones suavemente pipeteando y centrifuga brevemente usando una microcentrífuga. Después, añade un microlitro de EDTA a cada tubo.

Luego, mezcla bien y centrifuga brevemente como se mostró antes. Saca las muestras con código de barras en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Forma vórtice las perlas de limpieza de ADN para resuspenderlas completamente y añadir un volumen igual a 0,7 veces el volumen de muestra acumulado.

Mezcla la solución de muestra de perlas e incubala en un mezclador Hula a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, para preparar dos mililitros de etanol al 80%, mezclar 1.600 microlitros de etanol puro con 400 microlitros de agua libre de nucleasa. Coloca el tubo sobre una rejilla magnética durante cinco minutos hasta que el eluado parezca claro e incoloro.

Luego, retira y descarta el sobrenadante sin mover la bola. Lava las esferas con 700 microlitros de etanol recién preparado al 80% y centrifuga brevemente el tubo. Después de colocar el tubo en la rejilla magnética, retira el etanol residual.

Ahora, quita el tubo del soporte magnético. Suspende las perlas en 35 microlitros de agua sin nucleasas mediante un suave movimiento e incuba a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Devuelve el tubo al soporte magnético hasta que el eluado quede claro e incoloro.

Luego, transfiere 35 microlitros del eluato a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros para su uso posterior. Para la ligación del adaptador, mezclar los componentes en un tubo microcentrífuga de baja unión de 1,5 mililitros. Centrifuga el tubo brevemente e incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Vierte las perlas de limpieza de ADN para resuspenderlas completamente. Añade 20 microlitros de esferas al tubo y mezcla suavemente. Incuba en un Hula Mixer durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego, coloca el tubo sobre una estantería magnética para pelletar las perlas y aspirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Añade 125 microlitros de buffer de fragmentos cortos y da un suave golpecito al tubo para volver a suspender las perlas. Centrifuga brevemente y vuelve a colocar el tubo en la barra magnética.

Aspira el sobrenadante de nuevo después de que las cuentas se hayan pelletado. Ahora, retira el tubo del soporte magnético y vuelve a suspender las perlas en 15 microlitros de buffer de elución pipeteando suavemente o haciendo un golpeteo. Centrifuga brevemente el tubo para recoger el contenido y luego incubarlo a 37 grados Celsius durante 10 minutos para eluir el ADN.

Coloca el tubo sobre una rejilla magnética hasta que el eluado esté claro e incoloro. Luego, aspira 15 microlitros de eluato y transfiere a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para preparar la solución de cebado de la celda de flujo, mezcla bien los componentes dados.

Abre el puerto de cebado de la celda de flujo, aspira aproximadamente 20 microlitros de tampón para eliminar burbujas de aire y carga 800 microlitros de la mezcla de cebado en el puerto sin introducir burbujas de aire. Para preparar la biblioteca de ADN, mezcla cuidadosamente los componentes que aparecen en la pantalla. Levanta suavemente la tapa del puerto de muestra de la celda de flujo, carga 200 microlitros de mezcla de cebado en el puerto de cebado sin introducir burbujas de aire.

Después de mezclar la biblioteca de ADN preparada, carga 75 microlitros de la biblioteca gota a gota en el puerto de muestra de la celda de flujo de secuenciación. Cierra la tapa del puerto de la celda de flujo, asegurándote de que el tapón entre bien en el puerto de la muestra, y luego cierra bien el puerto de cebado. La electroforesis en gel confirmó la integridad del amplicón en casi todas las muestras, pero los carriles correspondientes a las muestras 89 y 136 mostraron bandas tenues o ausentes.

Las muestras 89 y 136 presentaron concentraciones insuficientes de amplicones, lo que llevó a su exclusión de la secuenciación de lectura larga. En todos los genes objetivo, las plataformas de lectura larga y corta alcanzaron altas profundidades de cobertura, con el gen EIS mostrando los valores medios más altos y el gen RRS mostrando las profundidades de cobertura más bajas. A pesar del rango de profundidad de cobertura, ambas plataformas mantuvieron una alta amplitud de cobertura del 99,9% en todos los genes asociados a la resistencia.

Se detectaron variantes de resistencia a fármacos para etambutol, fluoroquinolonas, kanamicina, amikacina y capreomicina con una concordancia del 100% en plataformas de secuenciación de lectura corta y larga. No se encontraron mutaciones asociadas a la resistencia para linezolido, bedaquilina y clofazimina utilizando ninguno de los dos enfoques de secuenciación. La detección de resistencia a estreptomicina mostró una menor concordancia entre plataformas, con solo un 71,43% de acuerdo.

La sensibilidad a la detección para genes clave rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA y pncA osciló entre el 89,47% y el 96,77% entre plataformas.