Perfil espacial completo de transcriptomas independientes de la especie a través de Stereo-seq

Nuestra investigación se centra en caracterizar en detalle el microambiente tumoral ovárico para identificar biomarcadores predictivos y terapéuticos. Por ejemplo, nos gustaría encontrar marcadores para predecir la respuesta y resistencia a la quimioterapia o nuevos objetivos terapéuticos para tratamientos de segunda línea. Los desafíos experimentales incluyen la manipulación de la muestra, la evaluación de la calidad de la muestra y el tiempo de procesamiento de la muestra.

En cuanto al análisis de datos, los desafíos incluyen aspectos como la escasez de los datos, similar a otros procesos de célula única o también el mapeo de áreas, especialmente regiones repetitivas. Tras retirar el N-Chip de secuenciación estéreo de su embalaje, anota el número de identificación del chip. Sin tocar la superficie del N-chip, limpia la lámina de vidrio con etanol al 100%.

Utilizando una micropipeta, aplica cuidadosamente 10 microlitros de resina cerámica curable por ultravioleta alrededor del borde del N-Chip de secuenciación estereoscópica. Utiliza un hisopo de espuma sellado para eliminar el exceso de resina, dejando solo una línea fina alrededor del borde de la viña. Coloca la corredera en el dispositivo de curado ultravioleta, asegurando que la superficie del chip no se toque.

Ahora coloca la astilla aplicada con resina sobre una máscara opaca en la fuente de luz ultravioleta de 405 nanómetros para iluminar la parte trasera del portaobjetos y cura durante cinco minutos. Tras el curado, utiliza hisopos de espuma sellados remojados en etanol 100% de grado molecular, luego 70% etanol y, finalmente, agua sin nucleasas para limpiar alrededor del borde aplicado con resina. Sumerge el chip tres veces en agua fresca libre de nucleasas usando un tubo cónico de 50 mililitros.

Con aire comprimido, seca la astilla con toda la fuerza del aire en un ángulo de aproximadamente 60 a 80 grados, moviéndose diagonalmente por la superficie desde unos cinco centímetros de distancia. A continuación, aplica 150 microlitros de solución de poli-L-lisina de forma uniforme en toda la superficie del chip e incuba el chip durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego retira la solución de poli-L-lisina del chip.

Después del segundo lavado, seca cuidadosamente los bordes de la lámina sin tocar la superficie de la astilla. Seca firmemente la astilla usando aire comprimido, como se ha demostrado antes. Al seccionar el tejido FFPE, no toque directamente el chip y cubra solo el 80% con papel higiénico.

Para preparar dos microlitros de solución de tinción de ADN monocatenario en un buffer SSC, diluir el reactivo de ADN monocatenario Qubit con un buffer SSC 5X. Crea una mezcla maestra de la solución de tinción usando una dilución de uno a 20 de inhibidor de ribonucleasa, una dilución de uno a 200 de la solución de ADN monocatenario y el volumen restante con un tampón SSC 5X. Añade 150 microlitros de solución de tinción a cada astilla y incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego, retira suavemente la solución de tinción de la esquina de cada astilla usando una pipeta. Después de lavar la astilla dos veces con buffer SSC 0,1X durante 10 a 15 segundos, seca cuidadosamente los bordes de la corredera. Añade aproximadamente tres a cinco microlitros de glicerol a la lámina para montarla.

Baja una cubierta desde aproximadamente un centímetro por encima del deslizador, manteniéndola nivelada y asegurándote de que no toque la superficie del chip. Captura imágenes fluorescentes de tejido teñido con ADN monocatenario usando un microscopio de campo amplio, asegurando un 10% de solapamiento entre las baldosas de imagen. Unir las imágenes adquiridas en software de procesamiento de imágenes como ImageJ utilizando primero la superposición teórica para generar posiciones aproximadas de las teselas y luego aplicando solapamientos computacionales de coincidencia de píxeles para afinar la teselatura.

Procesa las imágenes unidas en el software StereoMap y confirma que el control de calidad de imagen pasa antes de continuar. Sumergir la corredera de secuenciación estereoscópica en 30 mililitros de buffer SSC 0,1X hasta que la cubierta se desprenda. Asegúrate de que el reactivo de descruzamiento FFPE esté a temperatura ambiente e inspecciónalo en busca de partículas.

Enciende el termociclador y ponlo a 30 grados Celsius para equilibrar, 95 grados Celsius para una incubación de 30 minutos, y mantenlo infinito a cuatro grados Celsius. Monta la junta del casete y coloca la corredera del chip de secuenciación estéreo dentro del casete. Luego añade reactivo FFPE de descruzamiento en el pozo del cassette de corredera de secuenciación estéreo, aplica cinta de sellado al cassette y confirma que está bien sellado.

Comienza la incubación de 30 minutos a 95 grados Celsius. Después de 10 minutos, coloca 25 mililitros de metanol en un recipiente de 50 mililitros en un congelador a 20 grados Celsius, preparando aproximadamente un mililitro por lámina para su uso posterior. Después de retirar la astilla del termociclador, transfiere el casete deslizante al banco y despega la cinta de sellado.

Usando una pipeta, retira y descarta el reactivo de descruzamiento FFPE del casete. Una vez que el reactivo haya sido completamente retirado, desconecta el cassette y la junta y deséchalos. Bajo una campana extractora estéril, seca el borde de la corredera y aplica una nueva cámara de silicona si es necesario.

Añade 500 microlitros de metanol frío del congelador a 20 grados Celsius, asegurando que toda la sección quede sumergida. Precalenta la solución PR en un bloque seco a 37 grados Celsius durante 10 minutos antes de usarla. Tras la fijación, en una campana extractora, limpia el exceso de metanol de la lámina y espera a que el metanol restante en el chip se evapore.

Monta una nueva junta final de casete. Una vez completada la evaporación, coloca la llave del chip de secuenciación estéreo en el casete. Añade 200 microlitros de reactivo de permeablización precalentado al chip.

Aplica cinta de sellado al cassette de corredera de secuenciación estéreo y asegúrate de que esté bien sellado. Realiza transcripción inversa y luego liberación y purificación de CDNA siguiendo los pasos que se muestran aquí. Precalienta agua libre de nucleasas a 37 grados Celsius.

Quita el sello del chip. Pipetea vigorosamente en cada esquina y en el centro del desconchón sobre el pañuelo, sin raspar ni tocarlo. Recoge toda la mezcla de liberación de ADN complementaria del chip y transfierela a un tubo centrífuga de 1,5 o 2,0 mililitros.

Añade 350 microlitros de agua precalentada sin nucleasa directamente sobre la superficie del chip. Pipetea vigorosamente con una pipeta más pequeña, inclinando la punta para aplicar fuerza de pura fuerza sin tocar el tejido ni raspar la astilla. Combina el lavado con los 400 microlitros de mezcla de liberación de ADN complementaria recogida anteriormente, asegurando que solo se combine el material de un solo chip.

Coloca 100 microlitros de agua libre de nucleasas en el chip. Sella la diapositiva de secuenciación estéreo y guárdala en la nevera hasta que termine el protocolo. La segmentación de célula única utilizando la tubería SAW se logró en secciones FFPE, permitiendo el mapeo a ARN no poliadenilados como el ARNt y TRDMT1.

La visualización espacial interactiva mostró tipos celulares potenciales utilizando el software propietario StereoMap, con grupos mostrados en varios colores a lo largo de una región ampliada del tejido. La expresión de tejido completo del ARN no poliadenilado TRDMT1 se visualizó usando StereoPi. Las adaptaciones del protocolo abordan los problemas que tuvimos en el perfilado espacial transcriptómico completo de tejidos grasos y frágiles, mejorando la adhesión tisular, la accesibilidad del ARN y el manejo de las secuencias estereoscómicas en estos tipos de tejido difíciles.

Actualmente, el stereo-seq ofrece una resolución superior a otros métodos transcriptómicos espaciales, con una resolución de 500 nanómetros frente a dos micras. También proporciona una captura imparcial necesaria para el estudio del microbioma, los transcritos virales y no poliadenilados.