Name: Extremo 3 secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprende a elaborar bibliotecas de secuenciación de extremos 3' de mRNA con el protocolo A-seq2. Este método permite estudiar procesamiento de pre-mRNA, poliadenilación alternativa y cuantificación de expresión génica.

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Los autores agradecen la Sra. Béatrice Dimitriades para ayuda con el cultivo celular. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza de ciencia becas #31003A_170216 y 51NF40_141735 (NCCR ARN &#38; enfermedad).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
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<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
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<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li>
<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La multitud de base y factores auxiliares que intervienen en el proceso de pre-mRNA 3' final se refleja en un paisaje de poliadenilación proporcionalmente complejo. Además, también es sensible a los cambios en otros procesos como la transcripción y splicing de poliadenilación. 3' extremo escote sitios pre-mRNAs se identifican típicamente basado en las colas de poly(A) características que se agregan a los productos de escote 5'. Mayoría de los métodos utiliza iniciadores oligo(dT) de longitudes variables que permiten la conversión específica de poli (A)-que contienen mRNAs a cADN en una reacción de transcripción reversa. Un problema común de este enfoque es cebado interno a las secuencias de A ricos en sitios de clivaje artifactual. Se han propuesto dos métodos que intentan eludir este artefacto en la etapa de preparación de la muestra. En el método de 3P-seq 1, adaptadores se unen específicamente a los extremos de las colas de poly(A) de con ayuda de un oligo de férula seguida parcial digestión Rnasa T1 y transcripción reversa con TTP en la reacción como los Deoxinucleótidos solamente. El heterodúplex resultantes de poly(A)-poly(dT) luego es digeridos con Rnasa H y los restantes fragmentos de RNA aislados, ligados a los adaptadores y secuenciados. Un método más simple y elegante, 2P-seq, que utiliza una cartilla de secuenciación personalizada omitiendo el tramo restante de oligo(dT) en la reacción de secuenciación se informó por los mismo autores 2. En un método relacionado, 3' Lee 3, una cartilla inusualmente larga de 5 nosotros y 45 Ts, que también contiene una biotina es recocidos ARN fragmentado, seguido de lavados rigurosos para seleccionar moléculas de ARN con poly(A) colas de más de 50 nucleótidos. Aunque 3' Lee reduce drásticamente la frecuencia de cebado interno, no completamente elimina lo 3. Protocolos para la secuencia directa del RNA también se han propuesto, pero las lecturas resultantes son cortas y tienen una alta tasa de error y este enfoque no ha sido más desarrollado 18,19,20. La Seq de PolyA y de los protocolos de Quant Seq comercializados combinan oligo(dT) base de cebado con un paso de cebado al azar para el cDNA segunda hebra síntesis 20. El uso de la reacción de transcripción reversa interruptor de plantilla con la transcriptasa reversa de los Virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) conduce a la generación de cDNAs con conectores en un solo paso y así no dímeros adaptador pueden aparecer en los métodos SAPAS y PAS-Seq 21 , 22.
El método A-Sec2 presentamos destaca en su utilización de un nucleótido escindibles (dU) dentro de una cartilla de oligo(dT) biotinilado. Esta modificación combina la utilidad de enriquecer oligo(dT) cruzado por hibridación, contra objetivos con el retiro de la mayoría de la secuencia25 de oligo (dT) de los fragmentos aislados antes de que las bibliotecas están preparadas y la preservación de tres t, que indican la presencia previa de la cola de poly(A). En contraste, los métodos que utilizan la Rnasa H para quitar poly(A) de las moléculas de ARN al azar dejan varios como. Ya que en A-Sec2, la secuencia se realiza desde el extremo 3' de la anti-sentido, sitios de clivaje se predicen que se encuentra después el motivo NNNNTTT al principio de la secuencia cruda Lee. Los tetrámeros aleatorios no sólo sirven para permitir llamar sino también en la eliminación de artefactos de amplificación de PCR de base. UMIs más largas también pueden ser acomodados. La posibilidad de oscurecimiento interno permanece en A-Sec2 y trata de cómputo, en primer lugar descartando 3' termina con una secuencia descendente genómicamente codificados, A ricos y luego descartando 3' final clusters, lo que podrían explicarse por oscurecimiento interno en el Señal de poly(A) ricos A sí mismo. Un análisis reciente de sitios de poly(A) inferida únicamente por un gran número de protocolos indica que los sitios que son únicos a Sec2 A tengan el nucleótido esperado distribución y ubicación dentro de genes, similares a otros 3' extremo protocolos de secuenciación.
Un paso crítico en A-Sec2 es la selección de cofia RNA y el retiro de RNAs ribosomal y varios ARNs pequeños. Esto se hace más fácilmente por un kit de mRNA aislamiento con Perlas magnéticas de oligo (dT)25 . En principio, ARN total aislado con fenol que contienen soluciones también da alta calidad RNA que puede ser más sometido a la selección por el kit de aislamiento de mRNA o agarosa oligo (dT). Un paso que puede variar en A-Sec2 es el tratamiento con hidrólisis alcalina que pueden acortar o extender para obtener fragmentos de ARN de diferentes tamaños. Crítico es también que la adición de dATP 3' a 3' extremos de los fragmentos de RNA por la polimerasa de la poly(A) es eficaz. En el protocolo descrito aquí, este tratamiento se aplica a todos los fragmentos del RNA, para evitar concatemerization durante la reacción de ligadura. Por último, observamos que aunque ligasa RNA 1 se utiliza normalmente como una ligasa de RNA, también ligates eficientemente solo trenzado DNA, como lo hemos hecho aquí para ligar un adaptador en el extremo 5' de las moléculas de cDNA.
Así, A-Sec2 es un eficiente y fácil de implementar el protocolo para la identificación de sitios de procesamiento extremo 3' pre-mRNA. Desarrollos futuros podrían incluir reducir aún más la complejidad del protocolo y la cantidad de material necesario. El conjunto asociado de más herramientas de análisis de datos computacionales permiten el tratamiento homogéneo del extremo 3' secuencia de lecturas obtenidas con una amplia gama de protocolos.

La captura y la secuencia de mRNA 3' extremos permite el estudio del procesamiento de mRNA y la cuantificación de la expresión génica. Debido a sus colas poly(A), mRNAs eucarióticos puede ser eficazmente purificado de lysates de la célula total con cuentas inmovilizadas oligo-deoxythymidine (moléculas de oligo(dT)), que también puede cebar la síntesis de cDNA. Sin embargo, este enfoque tiene dos inconvenientes. Tramos de la A que es internos de las transcripciones pueden también primer síntesis de cDNA, dando por resultado falsas poly(A) sitios. Tramos de poly(A) segundo, homogéneo plantean desafíos específicos para la secuencia, además de no ser informativo para la identificación de la transcripción. Se han propuesto diversos enfoques para sortear estas limitaciones, tales como transcripción reversa a través de poly(A) colas seguidas de digestión Rnasa H ( 1de 3P-seq), el uso de una cartilla de secuenciación personalizada terminando en 20 Ts ( 2de 2P-seq), preselección de Fragmentos de ARN con poly(A) colas de más de 50 nucleótidos con una cartilla de45 CU5T seguido por digestión Rnasa H (3' Lee 3) y el uso de una cartilla de oligo-dT que contiene el adaptador de 3' en una horquilla (seq de A 4).
El recientemente desarrollado A Sec2 método 5 pretende eludir la secuencia a través de poly(A) y al mismo tiempo reducir al mínimo la proporción de dímeros que se generan por la uno mismo-ligadura de adaptadores, que ocurren particularmente cuando la concentración molar de adaptadores compensa la concentración de insertar. Este problema puede eliminarse cuando se unen ambos adaptadores al mismo tipo de Polinucleótido extremos como en A-Sec2, donde los adaptadores de 3' se unen al extremo 5' de fragmentos de ARN y los adaptadores de 5' a 5' extremos de los cDNAs después de reversa de la transcripción. El método es más conveniente que nuestro anteriormente propuesto A-seq - en que la secuencia estaba en el 5'-a-3' dirección por lo que requiere precisamente controlada RNA fragmentación-, manteniendo una alta exactitud de la identificación del sitio de poly(A). Alrededor del 80% de las lecturas secuenciadas en muestras típicas mapa únicamente al genoma y llevar a la identificación de más de 20.000 grupos de sitio poly(A), más del 70% de que se superponen con anotación 3' UTRs.
En Resumen, el protocolo A Sec2 comienza con fragmentación de mRNA y la ligadura de reversa-complemento 3' adaptadores a los extremos 5' de fragmentos de ARN. Poly (A)-que contienen ARN es entonces inversa transcrito con una cartilla de oligo(dT) largo de 25 nucleótidos (nt) que contiene un nucleótido de anclaje en el extremo 3', dU en la posicion 4 y biotina en el extremo 5', permitiendo que enlace del cDNA a granos magnéticos estreptavidina. La mayor parte de la cartilla, incluyendo biotina, se extrae el cDNA por clivaje en dU por la mezcla de enzima de usuario, que contiene uracilo ADN glicosilasa (UDG) y el ADN glicosilasa-liasa Endonuclease VIII. Esta reacción deja intactos extremos de la ligadura de un adaptador de 5' y la izquierda Ts tres después del escote quedan marcar la ubicación de la cola de poly(A). Porque los adaptadores de 5' y 3' se unen por la ligadura a los receptores de 5' extremos, no dímeros de adaptador se generan. Cuatro nucleótidos al azar-mers introducidos en principio Lee permite resolución de cluster en los instrumentos de la secuencia de vanguardia y también puede servir como identificador molecular único (UMI) para la detección y eliminación de artefactos de amplificación de PCR. El tamaño de la UMI puede aumentar más lejos como hace en otros estudios 6. El protocolo genera lecturas que son inversa complementaria al mRNA 3' extremos, todo comienza con un tetrámero aleatorio seguido por 3 Ts. procesamiento de lecturas que tiene el 3 Ts diagnóstico en su 5' final comienza con la corrección de artefactos de amplificación de PCR por explotando las UMIs, eliminación de secuencias 3' de adaptador y revertir la complementación. Dice que pudo haber originado de oligo(dT) cebado en sitios ricos en A internos también se identifican computacionalmente y desechados. Los sitios falsos suelen carecen de uno de los 18 bien caracterizado y poly(A) conservado señales que deben ser ubicado ~ 21 nucleótidos corriente arriba del escote aparente sitio 7.
El protocolo requiere unos 8 h tiempo práctica, sin contar el cultivo celular y las trompas durante la noche. El asociado lee análisis software permite una identificación de sitio de alta precisión poly(A). Desde el sitio de poly(A) clusters crearon basados en 4 muestras más destacadas en esta superposición de 84% del manuscrito (dos réplicas biológicas de siRNA control y células tratadas con si-HNRNPC) con un gen anotado y de éstos, superposición de 75% con un 3' UTR y 86% ya sea con un 3' UTR o un exón terminal. El coeficiente de correlación de Pearson de expresión de los extremos 3' de las muestras replicadas es 0,92, y por lo general se obtienen valores de sobre 0.9 con el método. Así, A-Sec2 es un método práctico que da resultados muy reproducibles.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra puro</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de Cordycepin (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>Viales de ADN de baja unión, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green dye</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>uso 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 o NextSeq 500 secuenciadores de próxima generación</td><td>Illumina</td><td>consultar con el proveedor</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerasa mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasa</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>poli(A) polimerasa, levadura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>poli(A) polimerasa, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>polinucleótido quinasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ARN ligasa 1, alta concentración</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>incluye PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit de limpieza de ARN</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, inhibidor de la ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superíndice IV transcriptasa inversa</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNasa</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USUARIO mezcla de enzimas</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 rejilla magnética</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Mezclador calefactado con tapa calefactada</td></tr><tr><td>Columnas MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline tampón de hidrólisis, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 parte de Na2CO3 0,1 M y 9 partes de NaHCO3 0,1 M. Agregue EDTA a 1 mM. Ajuste el pH a 9.2. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>5x tampón poli(A) polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA acetilado, 50% glicerol</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de unión a biotina <td>20 mM Tris&shy; Cl pH 7,5, 2 m NaCl, 0,1% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>TEN tampón</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&shy; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP&shy; </td></tr><tr><td>40Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Oligonucleotides según Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, para secuenciadores GA-IIx y Hiseq2000/2500</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&tímido; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, imprimación RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotina-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT<TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 1br<td>/>tttt 3'PCR</td></tr><tr><td></td> tactettstettettstettstettettstettstettettrtettsttt<td></td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'<</td></tr><tr><td>strong>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos según los kits de preparación de muestras de ARN pequeños TruSeq HT-Illumina TruSeq, para los secuenciadores HiSeq2000/2500 y NextSeq500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (ADN/ARN)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</td>><><TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Documentación</td></tr> <tr><td>para la multiplexación de Illumina:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con sec2 a

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Estudios en la última década han revelado una variedad compleja y dinámica de reacciones de poliadenilación y escote de pre-mRNA. mRNAs con largas regiones 3' no traducidas (UTRs) se generan en las células diferenciadas que proliferar las células expresan preferentemente transcripciones con corta 3' UTRs. Describimos el protocolo A-seq, ahora en su segunda versión, que fue desarrollado para asignar sitios de poliadenilación genoma y estudiar la regulación del proceso de pre-mRNA 3' final. También aprovecha este protocolo actual de Poliadenilato (colas de poly(A)) que se agregan durante la biogénesis de los mRNAs mamíferos más para enriquecer de mRNAs completamente procesados. Un adaptador de ADN con deoxyuracil en su cuarta posición permite que el proceso exacto de mRNA 3' final fragmentos de la secuencia. No incluye el cultivo de células y las trompas durante la noche, el protocolo requiere unos 8 h tiempo práctica. Junto con él, se proporciona un paquete de software fácil de usar para el análisis de los datos derivados de la secuencia. A-Sec2 y el software de análisis asociadas proporcionan una solución eficiente y confiable para la asignación del pre-mRNA 3' termina en una amplia gama de condiciones del 106 o menos células.

Poly (A)-que contiene el RNA fue aislado de las células cultivadas, fragmentadas por hidrólisis alcalina y cDNAs se hicieron por revertir la transcripción con las cartillas de oligo(dT). El ADNc resultante fue inmovilizada en granos de estreptavidina, dU fue hendida en la reacción de supresión específica de uracilo, adaptadores fueron ligados a 5' y 3' extremos del fragmento troceado y los rellenos fueron ordenados. La figura 1 muestra un esquema gráfico del experimento.
Para las células HeLa y HEK293, 106 células fueron suficientes para identificar los lugares de poly(A) para la gran mayoría de genes de la proteína-codificación al final del procedimiento. Sin embargo, para otros tipos de células o tejidos puede ser necesario probar la saturación en el número de sitios identificados poly(A) como el número de células utilizadas en el experimento aumenta. Resultados representativos de la PCR piloto paso y del fragmento de ADN, análisis de la muestra antes de la secuencia se muestran en la figura 2.
La figura 3 muestra los pasos de preprocesamiento del análisis computacional, a partir del fichero fastq obtenidos desde el secuenciador y terminando con la marcada calidad, tapizados en adaptador Lee que están dispuesta a asignar al genoma. La figura 4 muestra los pasos de análisis que comienza con la asignación de las lecturas al genoma correspondiente y al final con el catálogo de lugares que se identifican en una muestra particular de procesamiento extremo 3' mRNA. Cuando se analizan las muestras múltiples, pasos adicionales se llevan a cabo a coincida con el extremo 3' sitios que fueron encontrados en las muestras individuales de procesamiento e informe su abundancia a través de las muestras. Estos pasos se muestran en la figura 5.
Así, una vez que las muestras han sido secuenciadas, el análisis de la secuencia que resulta leer los archivos (en formato fastq) a través de la canalización de procesamiento disponible es sencillo. Después de agregar la información sobre las muestras para el archivo de configuración, la ejecución del gasoducto dará como resultado dos tipos principales de archivos de salida: 1) cama-archivos con todos 3' extremo procesamiento de sitios identificados en muestras individuales (p. ej. " sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") y 2) un archivo de cama con los racimos de sitio poly(A) (clusters.merged.bed) a través de todas las muestras del estudio. La salida también incluye las coordenadas de genoma de todas las lecturas de cada muestra individual (e.g. "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.Bam") que luego podrás visualizar en un navegador de genoma como IGV16. Inspección visual de los perfiles leerlas generalmente proporciona un primer vistazo de la distribución de los sitios de poly(A) en el genoma y los cambios que ocurren en las perturbaciones específicas que se llevaron a cabo en el estudio. Por ejemplo, en la figura 6 se muestra la respuesta de un gen específico a la precipitación de la proteína HNRNPC.
Resúmenes de estas distribuciones del genoma también se ofrecen (cuadro 1). Específicamente, los archivos de salida en el directorio "cuentas/annotation_overlap" contienen fracciones de sitios que se solapan con las características anotadas (desde el archivo gtf proporcionado como entrada, anotado son: 3' UTR, exón terminal, exón, intrón, intergénico). Finalmente, para cada muestra, resultados de pasos de proceso individuales también se guardan (por ejemplo, "sample1.summary.tsv"). Esto incluye los números de: Lee cruda en cada muestra, dice que tienen la estructura esperada del extremo 5', dice que quedan tras sufrir un colapso completos duplicados de la polimerización en cadena, alta calidad Lee según los criterios definidos en el paso 9.2, lee el mapa únicamente para el genoma (tras sufrir un colapso que dio como resultado de errores de secuencia, ver paso 9.5), asignación de múltiples Lee (tras sufrir un colapso que dio como resultado de errores de secuencia, ver paso 9.5), crudo (no agrupado) 3' extremo sitios en cada muestra, cruda 3' extremo sitios de procesamiento de procesamiento sin candidatos de oscurecimiento interno, único 3' extremo sitios de procesamiento de las muestras sin candidatos cebado interno y el conjunto final de grupos de sitio de poly(A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: pasos principales del Protocolo A Sec2. Pasos individuales se indican en el lado izquierdo de la figura. Insertar fragmentos de ARN se representan como líneas verdes que rojos de cDNA después transcripción inversa; adaptadores son de color azul claro o naranja. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: piloto de PCR y el perfil del producto final. (un) alícuotas de la reacción de PCR se recolectaron en diferentes ciclos y separaron en geles de agarosa al 2%. Números a la izquierda indican el tamaño en nucleótidos de las respectivas bandas en la escalera de ADN. En este experimento se eligieron 12 ciclos (*) para la reacción de polimerización en cadena a gran escala. (b) ejemplo de una muestra después de la preselección en un analizador de tamaño de fragmento revela un tamaño medio de unos 280 nucleótidos. Números a la izquierda [FU] indican la intensidad relativa de la señal. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: esquema de tratamiento previo de la secuenciación Lee. Se procesan los archivos fastq con lecturas que son generados por el software de secuenciación asociadas instrumento para identificar lecturas de alta calidad que se asignan al genoma correspondiente. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a cada paso del protocolo descrito en la sección "Procesamiento de datos". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: esquema de la secuencia Lee proceso, del paso de asignación el genoma a la generación del extremo 3' individuales sitios de procesamiento. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a la iindividual pasos del protocolo que se describe en la sección "Procesamiento de datos". El archivo de salida principal que se entrega al usuario está marcado en negrita. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: esquema de los pasos que se toman para generar racimos de extremo Co regulada 3' secuencia sitios. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a cada paso del protocolo descrito en la sección "Procesamiento de datos". El archivo de salida principal está marcado en negrita. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: resultados del ejemplo del perfil de 3' extremo procesamiento Lee a lo largo del terminal exón del gene de NUP214, se muestra en el navegador de genoma IGV 16 . Se prepararon A Sec2 Lee de dos muestras de células de HEK 293, tratadas con un siRNA control o con un siRNA HNRNPC. La lee que poly(A) sitios que fueron anotados por la tubería del análisis se guarda en formato BAM que se utilizó como entrada para el browser del genoma IGV. Los extremos 3' de los picos de lectura mapa al mRNA 3' extremos que se anotan en el Ensembl. Los perfiles indican un uso creciente de la isoforma larga 3' UTR con HNRNPC precipitación. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Si Control repetición 1</td>
			<td>repetición si Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas raws</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas válidas después de recortar y filtrado</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de asignación únicamente Lee</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas a múltiples loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de los 3' extremo sitios de procesamiento</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: ejemplo de salida de la tubería análisis. Resúmenes de lecturas que se obtuvieron en pasos individuales.

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

El objetivo general de este método es capturar y secuenciar los extremos tres primos del ARNm, lo que permite estudios sobre el procesamiento del ARNm, particularmente la escisión del extremo tres primo y la poliadenilación, así como la cuantificación de la expresión génica. El protocolo A-seq2 y el paquete de análisis de datos presentados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la generación y función de los isoformas de transcritos en diferentes tipos celulares y tejidos. Las principales ventajas del método A-seq2 son que evita el secuenciamiento a través de largas secuencias poli(A) y que no genera dímeros de adaptadores.Se utilizan células cultivadas hasta una confluencia del 80 %. Retire el medio de crecimiento y lave las células una vez con PBS. Lise directamente las células en la placa añadiendo un mililitro de tampón de lisis por pocillo y utilizando una espátula de goma para desprender completamente el material celular de la superficie de la placa.Utilice una punta de pipeta de un mililitro para transferir el lisado viscoso de cada pozo a un tubo plástico de 15 mililitros. Pase el ADN a través de una jeringa de un mililitro conectada a una aguja hipodérmica de calibre 23. Realice varios movimientos vigorosos hacia arriba y hacia abajo del émbolo hasta que el lisado ya no sea viscoso.Transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue a 20.000 ×g y 4 °C durante cinco minutos para eliminar los residuos. Recopile el sobrenadante claro del lisado.Agregue a las perlas magnéticas de oligo d(T)25 y resuspenda la mezcla. Coloque los tubos en una rueda rotatoria durante 10 minutos. A continuación, coloque los tubos en un soporte magnético durante dos minutos.Retire el líquido transparente. Añada 0,8 mililitros de tampón A a cada tubo y gire el tubo 180 grados dos o tres veces. Retire el tampón A del segundo lavado.Añada 0,8 mililitros del tampón B a cada tubo y déjelos en la rejilla durante dos minutos. Para eluir el ARNm unido a las perlas, elimine el tampón B, añada 33 microlitros de agua a cada tubo y resuspenda las perlas. Incube a 75 grados Celsius durante cinco minutos en un bloque calefactor.Inmediatamente, centrifugue los tubos durante un segundo y colóquelos en el soporte magnético. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Añada 66 microlitros de tampón de hidrólisis alcalina a cada tubo, mezcle y caliente a 95 grados Celsius durante exactamente cinco minutos en un bloque calefactor.Inmediatamente, enfríe los tubos en hielo. Posteriormente, realice el aislamiento de ARN utilizando un kit de purificación de ARN, como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar este procedimiento, agregue a cada muestra de ARN 14 microlitros de una mezcla maestra de polinucleótido cinasa.Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, cargar las reacciones de quinasa en columnas de centrifugación preparadas. Centrifugar las columnas a 735 ×g durante dos minutos.Deseche las columnas y coloque los tubos con las reacciones recolectadas en hielo. Para bloquear los extremos tres primas de los fragmentos de ARN y evitar su concatemerización en reacciones de ligación posteriores, agregue a cada muestra 17,5 µL de una mezcla maestra de poli(A) polimerasa. Mezcle y centrifugue durante un segundo.Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, añadir 32,5 microlitros de agua a cada reacción y purificar el ARN, como se describe en el protocolo escrito. Comience este procedimiento colocando las reacciones en un concentrador al vacío durante 10 minutos, para reducir el volumen a seis microlitros.Luego, agregue a cada reacción 24 microlitros de una mezcla maestra de ARN ligasa. Incube las reacciones en un mezclador térmico a 24 grados Celsius durante 16 horas, con mezclado intermitente a mil RPM. Al día siguiente, agregue 17 microlitros de agua a cada reacción y mezcle.Purifique el ARN, como se describe en el protocolo escrito. Coloque los eluidos en un concentrador al vacío durante tres minutos, para reducir el volumen a 11 microlitros. Transfiera las reacciones a tubos PCR de 200 microlitros para la reacción de transcripción inversa.Agregue un microlitro de cebador. Incube a 70 grados Celsius en un termociclador PCR durante cinco minutos y luego deje a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añada ocho microlitros de una mezcla maestra de transcripción inversa a cada tubo y mezcle.Coloque los tubos en un termociclador. Caliente a 55 grados Celsius durante 10 minutos y luego a 80 grados Celsius durante otros 10 minutos. Mantenga en hielo.Prepare las perlas de estreptavidina, como se describe en el protocolo escrito. Añada la reacción de transcripción inversa a la solución de perlas e incube a cuatro grados Celsius en una rueda rotatoria durante 20 minutos. Mediante un soporte magnético, lave las perlas dos veces con tampón de unión a biotina y dos veces con tampón TEN.Resuspenda las perlas en 50 microlitros de tampón TEN. Añada dos microlitros de mezcla enzimática de uracilo DNA glicosilasa e incube a 37 grados Celsius durante una hora en un mezclador, con mezcla intermitente. Añada 50 microlitros de agua, 11 microlitros de tampón RNasa H y un microlitro de RNasa H a cada reacción.Incubar a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético y transfiera el líquido que contiene el ADNc escindido a un tubo nuevo. Purifique el ADNc escindido utilizando un kit de purificación de PCR, como se describe en el protocolo del texto.Coloque el ADNc purificado en un concentrador al vacío durante ocho minutos para concentrarlo hasta un volumen de siete microlitros. Para ligar los adaptadores de cinco primarios a los extremos de cinco primarios del ADNc aislado, añada a cada muestra 23 microlitros de una mezcla maestra de ligasa de ARN e incube a 24 grados Celsius durante 20 horas. Por último, añada 70 microlitros de agua a cada reacción.Se realiza una PCR piloto para determinar el número óptimo de ciclos de PCR para alcanzar la amplificación de la biblioteca, dentro de la fase exponencial. Pipetee lo siguiente en un tubo de PCR de 200 microlitros: 25 microlitros de mezcla de ADN polimerasa, 20 microlitros de reacción de ligación, dos microlitros de agua, 1,5 microlitro de cebador PCR directo y 1,5 microlitro de cebador inverso de índice PCR. Ejecute el termociclador con el siguiente programa: tres minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 20 ciclos de 20 segundos a 98 grados Celsius, 20 segundos a 67 grados Celsius y 30 segundos a 72 grados Celsius.Recolecte alícuotas de siete microlitros directamente del termociclador, tras los ciclos indicados. Separe los productos en un gel de agarosa al 2% y visualice la migración de los productos de PCR. Determine el número de ciclos al inicio de la amplificación exponencial, 12 ciclos en este ejemplo, y utilice este número de ciclos para una reacción de PCR a gran escala.Separar los productos de la reacción de PCR a gran escala en un gel de agarosa al 2% y cortar las porciones del gel que contienen productos de ADN de 200 a 350 nucleótidos. Posteriormente, extraer el ADN de los fragmentos de gel con el kit de extracción de geles, según se describe en el protocolo escrito. En este video se mostrarán únicamente los pasos computacionales más importantes.Se pueden encontrar más detalles en el protocolo escrito. Comience clonando el repositorio Git y cambiando al directorio recién creado. Cree un entorno que contenga el software y active este entorno.Descargue la secuencia del genoma del organismo del cual se han obtenido los datos de A-seq2. Abra el archivo de configuración y establezca los parámetros de entrada, tal como se indica en el protocolo escrito. Inicie el análisis.Se examinó la respuesta de un gen específico, NUP214, al silenciamiento del ARNc de la proteína HNRNPC, analizando lecturas a-seq2 provenientes de dos muestras de células HEK-293, tratadas ya sea con un ARN interferente pequeño control o con un ARN interferente pequeño para HNRNPC. Las lecturas que documentaron sitios poli(A) anotados por la canalización de análisis se guardaron en formato BAM, el cual se utilizó como entrada para el navegador genómico IGD. Los extremos tres primos de los picos de lecturas se ubicaron en los extremos tres primos del mARN mensajero que están anotados en ensemble.Los perfiles indican un aumento en el uso del isoforma largo de la región UTR 3' tras el silenciamiento de HNRNCR. Una vez dominado, el protocolo A-seq requiere ocho horas de trabajo práctico o aproximadamente dos o tres días, sin incluir el tiempo para el cultivo celular y las ligaciones nocturnas. Al intentar el protocolo, es importante diseñar primero un conjunto inicial que cumpla con la plataforma de secuenciación utilizada en su ubicación.Una vez obtenidos los extremos tres primos de mMRA, se pueden realizar otros métodos, como la ligación cruzada y la inmunoprecipitación, para identificar reguladores del procesamiento de los extremos tres primos del pre-mARN. A-seq2 allanó el camino para que los investigadores en el campo del procesamiento de ARN exploraran la regulación y las consecuencias de la poliadenilación alternativa en tipos celares individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo generar bibliotecas de extremos tres primos de ARNm, analizar sus datos de secuenciación, identificar nuevos sitios de poli(A) y cuantificar su uso.Esperamos que A-seq2 facilite su trabajo para comenzar el estudio de la regulación del procesamiento de ARNm y conduzca a muchos nuevos descubrimientos.

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