Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

El objetivo general de este método es capturar y secuenciar los extremos tres primos del ARNm, lo que permite estudios sobre el procesamiento del ARNm, particularmente la escisión del extremo tres primo y la poliadenilación, así como la cuantificación de la expresión génica. El protocolo A-seq2 y el paquete de análisis de datos presentados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la generación y función de los isoformas de transcritos en diferentes tipos celulares y tejidos. Las principales ventajas del método A-seq2 son que evita el secuenciamiento a través de largas secuencias poli(A) y que no genera dímeros de adaptadores.

Se utilizan células cultivadas hasta una confluencia del 80 %. Retire el medio de crecimiento y lave las células una vez con PBS. Lise directamente las células en la placa añadiendo un mililitro de tampón de lisis por pocillo y utilizando una espátula de goma para desprender completamente el material celular de la superficie de la placa.

Utilice una punta de pipeta de un mililitro para transferir el lisado viscoso de cada pozo a un tubo plástico de 15 mililitros. Pase el ADN a través de una jeringa de un mililitro conectada a una aguja hipodérmica de calibre 23. Realice varios movimientos vigorosos hacia arriba y hacia abajo del émbolo hasta que el lisado ya no sea viscoso.

Transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue a 20.000 ×g y 4 °C durante cinco minutos para eliminar los residuos. Recopile el sobrenadante claro del lisado.

Agregue a las perlas magnéticas de oligo d(T)25 y resuspenda la mezcla. Coloque los tubos en una rueda rotatoria durante 10 minutos. A continuación, coloque los tubos en un soporte magnético durante dos minutos.

Retire el líquido transparente. Añada 0,8 mililitros de tampón A a cada tubo y gire el tubo 180 grados dos o tres veces. Retire el tampón A del segundo lavado.

Añada 0,8 mililitros del tampón B a cada tubo y déjelos en la rejilla durante dos minutos. Para eluir el ARNm unido a las perlas, elimine el tampón B, añada 33 microlitros de agua a cada tubo y resuspenda las perlas. Incube a 75 grados Celsius durante cinco minutos en un bloque calefactor.

Inmediatamente, centrifugue los tubos durante un segundo y colóquelos en el soporte magnético. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Añada 66 microlitros de tampón de hidrólisis alcalina a cada tubo, mezcle y caliente a 95 grados Celsius durante exactamente cinco minutos en un bloque calefactor.

Inmediatamente, enfríe los tubos en hielo. Posteriormente, realice el aislamiento de ARN utilizando un kit de purificación de ARN, como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar este procedimiento, agregue a cada muestra de ARN 14 microlitros de una mezcla maestra de polinucleótido cinasa.

Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, cargar las reacciones de quinasa en columnas de centrifugación preparadas. Centrifugar las columnas a 735 ×g durante dos minutos.

Deseche las columnas y coloque los tubos con las reacciones recolectadas en hielo. Para bloquear los extremos tres primas de los fragmentos de ARN y evitar su concatemerización en reacciones de ligación posteriores, agregue a cada muestra 17,5 µL de una mezcla maestra de poli(A) polimerasa. Mezcle y centrifugue durante un segundo.

Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, añadir 32,5 microlitros de agua a cada reacción y purificar el ARN, como se describe en el protocolo escrito. Comience este procedimiento colocando las reacciones en un concentrador al vacío durante 10 minutos, para reducir el volumen a seis microlitros.

Luego, agregue a cada reacción 24 microlitros de una mezcla maestra de ARN ligasa. Incube las reacciones en un mezclador térmico a 24 grados Celsius durante 16 horas, con mezclado intermitente a mil RPM. Al día siguiente, agregue 17 microlitros de agua a cada reacción y mezcle.

Purifique el ARN, como se describe en el protocolo escrito. Coloque los eluidos en un concentrador al vacío durante tres minutos, para reducir el volumen a 11 microlitros. Transfiera las reacciones a tubos PCR de 200 microlitros para la reacción de transcripción inversa.

Agregue un microlitro de cebador. Incube a 70 grados Celsius en un termociclador PCR durante cinco minutos y luego deje a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añada ocho microlitros de una mezcla maestra de transcripción inversa a cada tubo y mezcle.

Coloque los tubos en un termociclador. Caliente a 55 grados Celsius durante 10 minutos y luego a 80 grados Celsius durante otros 10 minutos. Mantenga en hielo.

Prepare las perlas de estreptavidina, como se describe en el protocolo escrito. Añada la reacción de transcripción inversa a la solución de perlas e incube a cuatro grados Celsius en una rueda rotatoria durante 20 minutos. Mediante un soporte magnético, lave las perlas dos veces con tampón de unión a biotina y dos veces con tampón TEN.

Resuspenda las perlas en 50 microlitros de tampón TEN. Añada dos microlitros de mezcla enzimática de uracilo DNA glicosilasa e incube a 37 grados Celsius durante una hora en un mezclador, con mezcla intermitente. Añada 50 microlitros de agua, 11 microlitros de tampón RNasa H y un microlitro de RNasa H a cada reacción.

Incubar a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético y transfiera el líquido que contiene el ADNc escindido a un tubo nuevo. Purifique el ADNc escindido utilizando un kit de purificación de PCR, como se describe en el protocolo del texto.

Coloque el ADNc purificado en un concentrador al vacío durante ocho minutos para concentrarlo hasta un volumen de siete microlitros. Para ligar los adaptadores de cinco primarios a los extremos de cinco primarios del ADNc aislado, añada a cada muestra 23 microlitros de una mezcla maestra de ligasa de ARN e incube a 24 grados Celsius durante 20 horas. Por último, añada 70 microlitros de agua a cada reacción.

Se realiza una PCR piloto para determinar el número óptimo de ciclos de PCR para alcanzar la amplificación de la biblioteca, dentro de la fase exponencial. Pipetee lo siguiente en un tubo de PCR de 200 microlitros: 25 microlitros de mezcla de ADN polimerasa, 20 microlitros de reacción de ligación, dos microlitros de agua, 1,5 microlitro de cebador PCR directo y 1,5 microlitro de cebador inverso de índice PCR. Ejecute el termociclador con el siguiente programa: tres minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 20 ciclos de 20 segundos a 98 grados Celsius, 20 segundos a 67 grados Celsius y 30 segundos a 72 grados Celsius.

Recolecte alícuotas de siete microlitros directamente del termociclador, tras los ciclos indicados. Separe los productos en un gel de agarosa al 2% y visualice la migración de los productos de PCR. Determine el número de ciclos al inicio de la amplificación exponencial, 12 ciclos en este ejemplo, y utilice este número de ciclos para una reacción de PCR a gran escala.

Separar los productos de la reacción de PCR a gran escala en un gel de agarosa al 2% y cortar las porciones del gel que contienen productos de ADN de 200 a 350 nucleótidos. Posteriormente, extraer el ADN de los fragmentos de gel con el kit de extracción de geles, según se describe en el protocolo escrito. En este video se mostrarán únicamente los pasos computacionales más importantes.

Se pueden encontrar más detalles en el protocolo escrito. Comience clonando el repositorio Git y cambiando al directorio recién creado. Cree un entorno que contenga el software y active este entorno.

Descargue la secuencia del genoma del organismo del cual se han obtenido los datos de A-seq2. Abra el archivo de configuración y establezca los parámetros de entrada, tal como se indica en el protocolo escrito. Inicie el análisis.

Se examinó la respuesta de un gen específico, NUP214, al silenciamiento del ARNc de la proteína HNRNPC, analizando lecturas a-seq2 provenientes de dos muestras de células HEK-293, tratadas ya sea con un ARN interferente pequeño control o con un ARN interferente pequeño para HNRNPC. Las lecturas que documentaron sitios poli(A) anotados por la canalización de análisis se guardaron en formato BAM, el cual se utilizó como entrada para el navegador genómico IGD. Los extremos tres primos de los picos de lecturas se ubicaron en los extremos tres primos del mARN mensajero que están anotados en ensemble.

Los perfiles indican un aumento en el uso del isoforma largo de la región UTR 3' tras el silenciamiento de HNRNCR. Una vez dominado, el protocolo A-seq requiere ocho horas de trabajo práctico o aproximadamente dos o tres días, sin incluir el tiempo para el cultivo celular y las ligaciones nocturnas. Al intentar el protocolo, es importante diseñar primero un conjunto inicial que cumpla con la plataforma de secuenciación utilizada en su ubicación.

Una vez obtenidos los extremos tres primos de mMRA, se pueden realizar otros métodos, como la ligación cruzada y la inmunoprecipitación, para identificar reguladores del procesamiento de los extremos tres primos del pre-mARN. A-seq2 allanó el camino para que los investigadores en el campo del procesamiento de ARN exploraran la regulación y las consecuencias de la poliadenilación alternativa en tipos celares individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo generar bibliotecas de extremos tres primos de ARNm, analizar sus datos de secuenciación, identificar nuevos sitios de poli(A) y cuantificar su uso.

Esperamos que A-seq2 facilite su trabajo para comenzar el estudio de la regulación del procesamiento de ARNm y conduzca a muchos nuevos descubrimientos.