Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

El objetivo general de este método es capturar y secuenciar los tres extremos primos del ARNm, lo que permite estudios del procesamiento del ARNm, en particular la escisión y la poliadenilación de los tres extremos primarios, así como la cuantificación de la expresión génica. El protocolo A-seq2 y el paquete de análisis de datos presentados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la generación y función de isoformas de transcripción en diferentes tipos de células y tejidos. Las principales ventajas del método A-seq2 son que evita la secuenciación a través de largos estiramientos de poly(A), y no genera dímeros adaptadores.

Para este procedimiento se utilizan células que crecen hasta un 80% de confluencia. Retire el medio de crecimiento y lave las células una vez con PBS. Lise directamente las células de la placa añadiendo un mililitro de tampón de lisis por pocillo y utilizando una espátula de goma para separar completamente el material de la célula de la superficie de la placa.

Utilice una punta de pipeta de un mililitro para transferir el lisado viscoso de cada pocillo a un tubo de plástico de 15 mililitros. Comparta el ADN con una jeringa de un mililitro conectada a una aguja hipodérmica de calibre 23. Realice varios movimientos vigorosos hacia arriba y hacia abajo del émbolo, hasta que el lisado ya no sea viscoso.

Transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mililitros. Girar a 20.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos, para eliminar los residuos. Recoja el sobrenadante claro del lisado.

Añadir a las perlas magnéticas oligo d(T)25 y volver a suspender la mezcla. Coloque los tubos en una rueda giratoria durante 10 minutos. A continuación, coloque los tubos en una rejilla magnética durante dos minutos.

Retire el líquido transparente. Agregue 0,8 mililitros de tampón A a cada tubo y gire el tubo 180 grados dos o tres veces. Retire el tampón A del segundo lavado.

Añade 0,8 mililitros de tampón B a cada tubo y déjalo en la rejilla durante dos minutos. Para eluir el ARNm unido a las perlas, retire el tampón B, agregue 33 microlitros de agua a cada tubo y vuelva a suspender las perlas. Caliente a 75 grados centígrados durante cinco minutos en un bloque de corazón.

Inmediatamente, gire los tubos durante un segundo y colóquelos en la rejilla magnética. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue 66 microlitros de tampón de hidrólisis alcalina a cada tubo, mezcle y caliente a 95 grados centígrados durante exactamente cinco minutos en un bloque calefactor.

Inmediatamente, enfríe los tubos en hielo. Posteriormente, realice el aislamiento de ARN utilizando un kit de limpieza de ARN, como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar este procedimiento, agregue a cada muestra de ARN 14 microlitros de una mezcla maestra de polinucleótidos quinasas.

Incubar a 37 grados centígrados, durante 30 minutos. Después de 30 minutos, cargue las reacciones de quinasa en columnas de centrifugación preparadas. Gire las columnas a 735 veces g durante dos minutos.

Deseche las columnas y coloque los tubos con las reacciones recolectadas en hielo. Para bloquear los tres extremos primarios de los fragmentos de ARN y evitar su concatemerización en reacciones de ligadura posteriores, añada a cada muestra 17,5 microlitros de una mezcla maestra de poli(A)polimerasa. Mezclar y girar durante un segundo.

Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, agregue 32,5 microlitros de agua a cada reacción y purifique el ARN, como se describe en el protocolo de texto. Inicie este procedimiento colocando las reacciones en un concentrador de vacío durante 10 minutos, para reducir el volumen a seis microlitros.

A continuación, añada a cada reacción 24 microlitros de una mezcla maestra de ARN ligasa. Incubar las reacciones en un mezclador calentado a 24 grados centígrados durante 16 horas, con mezcla intermitente a mil RPM. Al día siguiente, agregue 17 microlitros de agua a cada reacción y mezcle.

Purifique el ARN, como se describe en el protocolo de texto. Coloque los eluitos en un concentrador de vacío durante tres minutos, para reducir el volumen a 11 microlitros. Transfiera las reacciones a tubos de PCR de 200 microlitros para la reacción de transcripción inversa.

Agrega un microlitro de imprimación. Calentar a 70 grados centígrados en un ciclador de PCR durante cinco minutos y luego dejar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Agregue ocho microlitros de una Master Mix de transcripción inversa a cada tubo y mezcle.

Coloque los tubos en un ciclador de PCR. Caliente a 55 grados centígrados durante 10 minutos y a 80 grados centígrados durante otros 10 minutos. Mantener en hielo.

Prepare las perlas de estreptavidina, como se describe en el protocolo de texto. Agregue la reacción de transcripción inversa a la solución de perlas e incube a cuatro grados centígrados en una rueda giratoria durante 20 minutos. Con una rejilla magnética, lave las perlas dos veces con tampón aglutinante de biotina y dos veces con tampón TEN.

Vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón TEN. Añadir dos microlitros de mezcla de enzimas uracilo ADN glicosilasa e incubar a 37 grados centígrados durante una hora en una batidora, con mezcla intermitente. Agregue 50 microlitros de agua, 11 microlitros de tampón de RNasa H y un microlitro de Rnase H a cada reacción.

Incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Coloque los tubos en la rejilla magnética y transfiera el líquido que contiene el ADNc escindido a un nuevo tubo. Purifique el ADNc escindido utilizando un kit de purificación de PCR, como se describe en el protocolo de texto.

Coloque el ADNc purificado en un concentrador de vacío durante ocho minutos para concentrarse en un volumen de siete microlitros. Para ligar cinco adaptadores primarios a los cinco extremos primarios del ADNc aislado, agregue a cada muestra 23 microlitros de una mezcla maestra de ARN ligasa e incube a 24 grados centígrados durante 20 horas. Por último, agregue 70 microlitros de agua a cada reacción.

Se realiza una PCR piloto para determinar el número óptimo de ciclos de PCR para alcanzar la amplificación de la biblioteca, dentro de la fase exponencial. Pipetear lo siguiente en un tubo de PCR de 200 microlitros: 25 microlitros de mezcla de ADN polimerasa, 20 microlitros de reacción de ligadura, dos microlitros de agua, 1,5 microlitros de cebador de PCR directo y 1,5 microlitros de cebador de índice de PCR inversa. Haga funcionar el ciclador con el siguiente programa: tres minutos a 95 grados centígrados, seguidos de 20 ciclos de 20 segundos a 98 grados centígrados, 20 segundos a 67 grados centígrados y 30 segundos a 72 grados centígrados.

Recoja siete alícuotas de microlitros directamente del ciclador, después de los ciclos indicados. Separe los productos en un gel de agarosa al 2% y visualice la migración de los productos de PCR. Determine el número de ciclos al comienzo de la amplificación exponencial, 12 ciclos en este ejemplo, y utilice este número de ciclos para una reacción de PCR a gran escala.

Separe los productos de la reacción de PCR a gran escala en un gel de agarosa al 2% y corte las rodajas de gel que contienen de 200 a 350 productos de ADN de nucleótidos. Posteriormente, extraiga el ADN de las rodajas de gel con el kit de extracción de gel, como se describe en el protocolo de texto. En este vídeo solo se mostrarán los pasos computacionales más importantes.

Más detalles están disponibles en el protocolo de texto. Comience clonando el repositorio Git y cambiando al directorio recién creado. Cree un entorno que contenga el software y actívelo.

Descargar la secuencia del genoma del organismo, de la que se han obtenido los datos A-seq2. Abra el archivo de configuración y establezca los parámetros de entrada, como se indica en el protocolo de texto. Inicie el análisis.

La respuesta de un gen específico, NUP214, a la eliminación de la proteína HNRNPC, se examinó mediante el análisis de lecturas a-seq2 de dos muestras de células HEK-293, tratadas con un ARN interferente pequeño de control o con un ARN interferente pequeño HNRNPC. Las lecturas que documentaron los sitios poli(A)anotados por la canalización de análisis se guardaron en formato BAM, que se utilizó como entrada para el navegador del genoma IGD. Los tres extremos primos de los picos de lectura, mapeados en mMRNA, tres extremos primos que se anotan en conjunto.

Los perfiles indican un mayor uso de la isoforma UTR larga de tres primos tras el derribo de HNRNCR. Una vez dominado, el protocolo A-seq requiere ocho horas de tiempo de práctica o alrededor de dos a tres días, sin contar el tiempo para el cultivo celular y las ligaduras nocturnas. Al intentar el protocolo, es importante diseñar primero un conjunto primario que se ajuste a la plataforma de secuenciación utilizada en su ubicación.

Una vez obtenidos los tres extremos primos del mMRA, se pueden realizar otros métodos, como la reticulación y la inmunoprecipitación, para identificar los reguladores del procesamiento de los tres extremos primos del pre-ARNm. A-seq2 allanó el camino para que los investigadores en el campo del procesamiento de ARN exploraran la regulación y las consecuencias de la poliadenlilación alternativa en tipos celulares individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar bibliotecas de ARNm en tres extremos principales, analizar sus datos de secuenciación, identificar nuevos sitios de poli(A) y cuantificar su uso.

Esperamos que A-seq2 facilite su trabajo para iniciar la regulación del procesamiento del ARNm y conduzca a muchos nuevos conocimientos.