Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

El ámbito de la investigación de nuestro laboratorio es estudiar los mecanismos subyacentes del glaucoma y la microglía en la remodelación sinapsisal durante el desarrollo. Los desafíos experimentales actuales giran en torno a si la microglía está desensamblando activamente las sinapsis ganglionares de la retina o si simplemente están eliminando pasivamente los residuos. Comienza con la retina del ratón colocada sobre un papel de filtro y sécala con una toallita de laboratorio.

Invierte la retina sobre una placa de Petri MatTek. Pesa la retina usando cuentas metálicas o un anillo. Luego, añade de tres a cinco gotas de líquido cefalorraquídeo artificial.

Coloca la muestra bajo un microscopio confocal de disco giratorio y ajusta la configuración para previsualizar la retina. Recoge imágenes a lo largo del eje Z a una profundidad total de 10 a 20 micrómetros usando un tamaño de paso de 0,3 micrómetros. Mantén el intervalo de tiempo entre fotogramas entre 20 y 30 segundos para permitir un seguimiento fiable de las celdas.

Para realizar el renderizado superficial de la microglia, convierte el archivo de lapso de tiempo a formato IMS usando el software de conversión de archivos. Introduce los tamaños de vóxeles basándose en las propiedades de imagen adquiridas previamente. En el ámbito del software de análisis, haz clic en la carpeta observe para abrir el archivo convertido y asegurarte de que la imagen esté en vista 3D.

Para detectar microglias individuales, haz clic en el icono de añadir nueva superficie en la barra de herramientas de objetos. Selecciona solo segmentos en una región de interés, sigue las superficies a lo largo del tiempo, clasifica superficies y estadísticas objeto-objeto bajo la configuración del algoritmo. Luego, haz clic en el botón azul reproducir para continuar.

Elige el canal para renderizar la superficie. Opcionalmente, habilitar suavización para suavizar la creación de la superficie y entrar en el detalle de la superficie. En umbral, elige segmentación por aprendizaje automático para detectar celdas.

En datos de entrenamiento, usa las herramientas de pincel de fondo y primer plano. Dibuja pinceladas seleccionando el pincel deseado y usando shift más clic izquierdo. Asegúrate de que la interpolación esté activada, luego selecciona tren y predice.

Usa el puntero amarillo en el centro para navegar por el eje Z. Dibuja varios trazos a través de los planos X, Y y Z, y a lo largo de varios marcos temporales. Utiliza de tres a cinco trazos cortos por entrada, ajustando iterativamente hasta que se logre una superficie precisa.

Utiliza el rectángulo amarillo para alternar entre la pantalla de entrenamiento y la superficie real creada como comprobación final. Además, comprueba a lo largo del lapso de tiempo que la superficie coincida con la morfología celular. Cuando termines, desactiva los objetos divididos.

Ajusta el umbral del histograma de vóxeles para eliminar objetos pequeños y no conectados que no forman parte de la superficie primaria. Luego, edita la superficie manualmente para eliminar objetos superfluos o bordes cortados usando la herramienta tijera. Si se desea, establecen un umbral de huecos permitidos para el objeto y seleccionen el algoritmo de seguimiento para la celda móvil.

Filtra los objetos que no están asociados a la superficie principal. Una vez terminado, configura la pantalla de celdas móviles en un perfil transparente para visualizar los puntos para los siguientes pasos. Para detectar puntos PSD95 individuales, haz clic en el icono de la superficie azul en la barra de objetos de la barra.

Luego, selecciona los espacios de pista con el tiempo, clasifica los espacios y estadísticas objeto-objeto y pulsa play. Selecciona el canal fuente para el marcador sináptico. Desactiva el slicer y otros canales para visualizar solo PSD95.

Utiliza el botón de control y la herramienta de selección de punteros para estimar el diámetro XY del punto. Elige algunos puntos brillantes que persistan a lo largo de los fotogramas y desactiva la resta de fondo. Después, añade un filtro basado en la calidad del spot.

Ajusta el histograma para incluir puntos PSD95 precisos en todos los periodos de tiempo. Elimina los puntos de falsos positivos mediante edición. Alterna entre el cursor del cubo o del círculo para eliminar los puntos que duren solo uno o dos fotogramas.

Si se desea, establezca un umbral de huecos permitidos y elige el algoritmo de seguimiento para los puntos sinápticos. Filtrar pistas puntuales no asociadas a puntos reales usando un umbral de histograma para excluir las pistas de objetos pequeños. Define las clasificaciones usando la distancia más corta a la clasificación de superficies.

Envuelto como cualquier punto menor que cero micrómetros, contactado aproximadamente entre cero y 0,5 micrómetros de la superficie, y sin contacto como más de 0,5 micrómetros. Asigna etiquetas a los eventos usando las clasificaciones que encontrarás arriba. Una vez que las superficies y manchas representen adecuadamente la microglía y los puntos, exporta todas las estadísticas a la pestaña de estadísticas.

La microglía mostró un aumento en la longitud del desplazamiento del proceso tras la hipertensión ocular inducida por láser en comparación con el control. La velocidad de microglia fue significativamente mayor en ojos tratados con láser que en los controles. El número de eventos de contacto entre la microglía y el punto PSD95 aumentó tras el tratamiento con láser.

Los registros en time-lapse mostraron que las retinas tratadas con láser exhibían una mayor motilidad microglial y un aumento de las interacciones con los puntos PSD95 en comparación con las retinas de control. Nuestros hallazgos significativos han demostrado que hay un aumento en el número de microglías, la complejidad y la motilidad, y la colocalización sináptica tras la elevación transitoria de la presión intraocular en ratones. Nuestro protocolo ofrece imágenes ex vivo, que ayuda a evitar problemas de opacidad de cataratas y córnea, facilitando la configuración para experimentos más rápidos y un mayor rendimiento general.

Nuestros hallazgos avanzan en la investigación al permitir la visualización de interacciones microglía-neurona, comunicación celular y dinámica mediante líneas fluorescentes transgénicas, así como imágenes en time-lapse de alta resolución.