Microdisección multinivel y perfil funcional-estructural de ramas arteriales renales humanas

Nuestra investigación tiene como objetivo establecer métodos estandarizados para aislar y evaluar funcionalmente las ramas arteriales renales humanas, descubriendo mecanismos de disfunción vascular y guiando terapias dirigidas. Las investigaciones anteriores se basaron en modelos animales o imágenes indirectas, donde nuestra miografía con alambre refleja directamente la función de la arteria renal humana in vitro. Nuestro método permite un análisis vascular preciso y específico para humanos, superando las limitaciones de las especies y mejorando el desarrollo traslacional de fármacos.

Para comenzar, asegúrese de que el tejido renal permanezca completamente sumergido en líquido durante el transporte para mantener la viabilidad del tejido y la integridad estructural. Identifique visualmente el plano coronal localizando el hilio renal y alineando el corte para que pase a través de la pelvis renal y el borde convexo lateral. Con un bisturí estéril, divida el riñón a lo largo de este plano coronal para crear dos mitades simétricas y exponga las estructuras internas, como las pirámides y columnas renales.

Bajo un microscopio estereoscópico, use tijeras de microdisección y fórceps para separar meticulosamente las arterias interlobar, arqueada e interlobulillar en una placa de cultivo de fondo negro de 10 centímetros. Luego, retire suavemente el tejido y la grasa circundantes de las arterias disecadas en la misma placa de cultivo de fondo negro de 10 centímetros para limpiarlas a fondo. Con unas tijeras de microdisección, secciona las arterias limpias en anillos de aproximadamente dos milímetros de longitud para estudios de función vascular.

Inserte con cuidado el primer alambre guía en un anillo arterial en el plato. Dobla un lado del alambre guía en un ángulo de 90 grados y transfiere el anillo arterial con el alambre a la cámara. Antes de fijar el anillo arterial en el portamuestras, registre la longitud del vaso.

Coloque el anillo entre los dos soportes y lea la escala micrométrica, donde una división de escala equivale a 10 micrómetros. Reste el valor de escala inicial medido cuando los soportes se tocan entre sí para calcular la longitud y el ancho del anillo arterial. Luego, fije el anillo arterial en el portamuestras tipo almeja con los tornillos provistos por el instrumento, apretándolos en el sentido de las agujas del reloj.

Luego, pase un segundo alambre guía a través del anillo arterial. Enrolle el cable en el sentido de las agujas del reloj alrededor de los tornillos de fijación en ambos extremos, asegurándolo firmemente a la superficie del portamuestras. Seleccione Configuración de normalización en el menú DMT y establezca la calibración del ocular en un milímetro por división, la presión objetivo en 13,3 kilopascales, IC1 / IC100 en 0,9, el tiempo promedio en línea como tres segundos y el tiempo de retardo en 60 segundos.

Seleccione el canal correspondiente a la arteria de destino y abra la pantalla de normalización desde el menú DMT. En los campos correspondientes, introduzca los puntos finales del tejido, ya que a1 es igual a cero y a2 es igual a la longitud del vaso medida en milímetros. Ingrese el diámetro del cable como 40 micrómetros e ingrese la lectura del micrómetro de la escala.

Haga clic en Agregar punto para guardar los datos. Ahora aplique estiramiento pasivo y espere tres minutos. Ingrese la nueva lectura del micrómetro como el siguiente punto y haga clic en Agregar punto.

Agregue cinco mililitros de solución de iones de potasio 60 a la cámara para inducir una contracción mediada por potasio del vaso. Para lavar la solución de iones de potasio 60, agregue cinco mililitros de solución de Krebs tres veces. Para evaluar la contracción dependiente de la concentración inducida por fenilefrina, aplique fenilefrina acumulada en incrementos de medio logaritmo de 10 a la potencia de nueve a 10 negativos a la potencia de cuatro molares negativos.

Para pruebas de drogas adicionales, lave la cámara con cinco mililitros tibios de solución de Krebs al menos cinco veces hasta que la tensión vuelva a la línea de base y permanezca estable durante al menos 10 minutos. La arteria interlobular se diseccionó con éxito de la médula renal, mostrando una pared vascular gruesa y tejido adiposo circundante que requirió una extracción cuidadosa para preservar la integridad estructural. La arteria arqueada se aisló en la unión corticomedular, mostrando una pared vascular más delgada y una trayectoria arqueada.

Se identificó la arteria interlobulillar que atraviesa linealmente la corteza renal con una pared muy delgada y estrechamente integrada con el tejido cortical. El análisis histológico reveló que la arteria interlobular tenía la pared vascular más gruesa con una adventicia distinta, mientras que las arterias arqueadas e interlobulares exhibían paredes progresivamente más delgadas y menos capas de músculo liso. La normalización arterial implicó estiramiento mecánico repetido y estimulación inducida por potasio, estableciendo condiciones de tensión basales estables en todas las muestras.

La adición acumulada de fenilefrina de 10 a la potencia de nueve a 10 negativos a la potencia de las concentraciones de cuatro molares negativos indujo contracciones progresivamente más fuertes en los anillos arteriales de una manera dependiente de la dosis. En las arterias precontraídas con fenilefrina, el aumento de las concentraciones de acetilcolina de 10 a la potencia de ocho a tres veces 10 a la potencia de cinco molares negativos produjo vasodilatación dependiente de la concentración.