Venopunción de venas faciales para extracción de sangre murina

El objetivo de esta investigación es presentar un método de extracción de sangre optimizado para sujetos murinos. Este método reduce el tiempo y la habilidad necesarios para la extracción de sangre de pequeño volumen en ratones, pero aún prioriza las prácticas éticas y mínimamente invasivas. Los métodos de recolección de sangre a menudo son demasiado complicados.

Queríamos simplificarlo todo y demostrar que se puede lograr una lisis clara con un mínimo de tiempo, esfuerzo y materiales. Las principales ventajas de este protocolo sobre otras técnicas es devolver el tiempo a los investigadores. Este método es muy rápido y requiere muy pocos materiales o habilidades especializadas para ejecutarlo.

Para comenzar, etiquete cada tarjeta de jaula y ratón con un identificador de fenotipo que coincida con las etiquetas correspondientes en los tubos de recolección. Marque las colas de los ratones con un marcador permanente para que se correspondan con las marcas en los tubos. Abra todas las lancetas y esponjas de gasa necesarias para el procedimiento y agregue de uno a dos mililitros de tampón de lisis a cada tubo etiquetado.

Ahora, con la mano dominante, agarre el ratón por la cola y colóquelo en una rejilla de alimentación de alambre o en una superficie plana. Con el dedo índice y el pulgar no dominantes, despegue al ratón maniobrando desde la cola hacia la región cervical. Luego, con los dedos restantes, asegure la cola para minimizar el movimiento del mouse.

A continuación, use la mano dominante para recuperar una lanceta abierta de tres milímetros. Ubique la pequeña mancha sin pelo justo más allá de la boca y trace una línea recta hacia la oreja. Deténgase donde la línea se cruza con la esquina exterior del ojo.

Ahora, inserte la lanceta en esta intersección para asegurar un amplio suministro de sangre y use el borde lateral plano de la lanceta para recolectar una sola gota de sangre. Luego deposite toda la lanceta con la sangre recolectada en el tubo marcado que contiene tampón de lisis de glóbulos rojos y agite suavemente el tubo para mezclar la sangre completamente con el tampón. Con una esponja de gasa, aplique una presión suave en el sitio de punción durante 5 a 10 segundos y regrese al ratón a su jaula.

Agregue aproximadamente dos mililitros de solución salina equilibrada de Hanks con EDTA 0,5 milimolares a cada tubo de muestra. Coloque los tubos en la centrífuga y centrifugue a 400 g durante cinco minutos. Durante este tiempo, prepare los cócteles de anticuerpos.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante de cada tubo. Luego, con fórceps, retire las lancetas de los tubos y agregue 30 microlitros de cóctel de anticuerpos en cada muestra. Agite las muestras durante dos o tres segundos para volver a suspender las células e incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante 25 a 30 minutos.

A continuación, encienda el citómetro de flujo y configure los gráficos de flujo de acuerdo con los requisitos experimentales. Con una pipeta de transferencia, agregue de 150 a 250 microlitros de solución salina equilibrada de Hanks u otros medios a cada muestra. Si es necesario, agregue DAPI a una concentración final de un microgramo por mililitro utilizando 100 microlitros de medios que contengan DAPI.

Agite cada muestra durante dos o tres segundos justo antes de la adquisición. Finalmente, verifique los reactivos y la configuración de ejecución del citómetro de flujo para la adquisición de datos. La citometría de flujo de ratones de tipo salvaje no mostró ninguna señal de tdTomato en las plaquetas, mientras que los ratones reporteros de Pf4-Cre mostraron distintas poblaciones de plaquetas positivas para tdTomato y células unidas a plaquetas positivas para tdTomato más grandes.

Los diagramas de dispersión lateral versus dispersión frontal de ratones de tipo salvaje y Pf4-Cre mostraron una clara separación entre los desechos celulares, los linfocitos y los granulocitos, lo que indica una lisis efectiva de glóbulos rojos y una estructura de muestra preservada. Se detectaron células B positivas para IGMA CD19 en ratones MD4Ighel, mientras que los ratones de tipo salvaje carecían de la señal IGMA a pesar de la positividad de CD19.