Purificación eficiente de polipéptidos similares a la elastina (ELPs) de E. coli mediante un método de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos

El alcance de esta investigación pregunta si la precipitación por extracción de disolventes puede purificar rápidamente las proteínas de fusión ELP manteniendo la función de actividad de fusión. Los desarrollos recientes incluyen la rápida purificación de ELP a base de disolventes con un mejor control de las endotoxinas, que permite nanopartículas autoensambladoras activas para la entrega dirigida de ácidos nucleicos. Para empezar, pesa un gramo de la pastilla de células de E. coli.

Añade cuatro mililitros de tampón de lisis recién preparado para volver a suspender el pellet celular. Agita el vórtice suavemente hasta que el pellet esté completamente disperso y mezclado con el buffer. Añadir aproximadamente cinco miligramos de lisozima a las células resuspendidas para ayudar en la digestión de la pared celular.

Luego coloca el tubo sobre hielo y incuba durante una hora. Tras la incubación, sonicar la muestra usando un sonador de sonda de punta micro en intervalos de cinco segundos. Mantenga la muestra sobre hielo y continúe la sonicación hasta obtener un lisado uniforme libre de partículas visibles, normalmente durante cinco a ocho minutos.

Centrifuga el lisado sonicado a 10.000 G durante 10 minutos a 20 grados Celsius para aclararlo. Luego se separa cuidadosamente el sobrenadante que contiene la fracción soluble del pellet que contiene la fracción insoluble. Extrae entre 10 y 20 microlitros del sobrenadante y resuspende una masa equivalente del pellet en el buffer de lisis.

Mezcla ambas fracciones con 4x tampón de Laemmli hasta una concentración final de 1x. Luego calienta la suspensión a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Si el ELP es predominantemente soluble, procede a la extracción con disolvente orgánico utilizando el sobrenadante clarificado.

Para realizar la extracción con disolvente, añadir cuatro mililitros de disolvente orgánico o mezcla de disolventes al pellet o sobrenadante secado al aire. Para mezclas de disolventes binarios, utiliza proporciones volumétricas exactas, como dos mililitros de cada uno para una combinación uno a uno. Agita la suspensión vigorosamente durante un minuto para asegurar una correcta penetración del disolvente en el pellet.

Ahora, incubar la mezcla a 20 grados Celsius durante cinco minutos para permitir la agregación de proteínas extracelulares y la solubilización de ELP en la fase orgánica. Centrifuga la muestra a 13.000 g durante 10 minutos a 20 grados Celsius para separar las proteínas solubilizadas de los restos insolubles. Recoge cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet, ya que contiene el ELP solubilizado.

Mide el volumen del sobrenadante recogido con precisión para prepararte para la precipitación. A continuación, añade acetona o acetonitrilo al sobrenadante a 2,33 veces su volumen para la precipitación de proteínas. Incuba la mezcla a 20 grados Celsius durante cinco a siete minutos.

Centrifuga la muestra a 10.000 g durante 10 minutos a 20 grados Celsius. Luego descarta el sobrenadante y seca al aire el pellet, ya sea bajo un suave chorro de nitrógeno durante 10 a 15 minutos o colocando tubos de centrífuga sin tapa boca abajo sobre toallitas sin pelusa en una campana extractora durante una hora a 20 grados Celsius. Resuspende el pellet de proteína seca en 50 microlitros de PBS.

Luego pipetea suavemente arriba y abajo para asegurar la disolución completa. Almacena la proteína resuspendida a menos 20 grados Celsius para uso a corto y medio plazo. Para realizar la validación usando SDS-PAGE, primero mezcla la proteína purificada con un buffer de carga 4x SDS-PAGE.

Haz un vórtice breve en la solución para lograr homogeneidad. Carga la muestra sobre un gel SDS-PAGE al 10% para ELP y TEEN fusionados para corismar mutasa. Haz funcionar el gel a 100 a 120 voltios hasta que la inmersión de seguimiento llegue al fondo.

Ahora, tiñe el gel con tinte InstantBlue Coomassie o una alternativa adecuada durante dos horas a 20 grados Celsius. Enjuaga con agua desionizada hasta que se obtenga un fondo claro. Una prominente banda ELP y TEEN fusionadas para corismar mutasa apareció en 100 kilodaltones tras un paso de lisis antes de la extracción orgánica.

Diferentes combinaciones de disolventes orgánicos resultaron en diferentes eficiencias y purezas de extracción de ELP y TEEN fusionados para corismar mutasa. Las mezclas uno a uno de AG y BG produjeron la mayor recuperación de proteínas. El ELP y TEEN extraídos por AG fusionados para corismar mutasa conservaron aproximadamente el 80% de su actividad enzimática en comparación con la proteína purificada por ITC, mientras que la glucosa retuvo alrededor del 50% de actividad, y el control V40 mostró casi ninguna actividad.

Entre los hallazgos significativos se encuentra la demostración de que la precipitación por extracción de disolventes orgánicos purifica rápidamente las fusiones ELP con baja endotoxina, preservando la actividad de proteínas de fusión. Este protocolo aborda la falta de métodos rápidos sin detergentes para purificar fusiones ELP de E.Coli con o sin cuerpos de inclusión sin ITC de varios pasos. Este protocolo ofrece una purificación rápida en un solo paso directamente a partir de pellets de E. coli, produciendo fusiones ELP altamente puras y bajas en endotoxinas, preservando la función de la proteína de fusión.