Name: En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a crear vesículas unilamelares de péptidos mediante rehidratación de película con microesferas de vidrio. Este protocolo permite incorporar extractos celulares sensibles para estudiar biología de membranas.

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Agradecemos el apoyo financiero a través de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, proyecto P15), el Consejo Europeo de Investigación (acuerdo de subvención no 694410 AEDNA) y la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (proyecto no 9.05) . Agradecemos a E. Falgenhauer por su ayuda con la preparación de muestras. Agradecemos a A. Dupin y M. Schwarz-Schilling por su ayuda con el sistema TX-TL y discusiones útiles. Agradecemos a N. B. Holland por sus útiles discusiones.

1. Expresión de polipéptidos similares a la elastrina
<ol><li>Día 1: Preparación de un cultivo inicial y suministros para la expresión de péptidos
	<ol>
<li>Preparación y autoclave de matraces de cultivo de expresión (4 x 2,5 L) y 3 L de medio LB. Para 1 L de medio LB, añadir 25 g de polvo LB a 1 L de agua ultrapura.</li>
		<li>Preparar un cultivo de arranque con 100 ml de medio LB, 50 ml de solución de cloramphenicol filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 50 ml de solución de carbenicilina filtrada estérilmente (100 mg/ml en 50% De EtOH y 50% de agua ultrapura).</li>
		<li>Añadir una pequeña veta de un stock bacteriano prefabricado que contiene E. coli cepa BL21(DE3)pLysS con el vector de expresión pET20b(+) codificando la secuencia de polipéptidos MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abreviado como EF) a un cultivo de arranque precalentado de 100 ml e incubar a 37 oC durante 16 h con 250 rpm en una incubadora de agitación (las cepas y vectores deE. coli están disponibles bajo petición).</li>
		<li>Precalienta los matraces de cultivo de expresión y los medios LB a 37oC durante la noche para que estén preparados para el día siguiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2: Expresión de proteínas
	<ol>
<li>Añadir 750 ml de medio LB a cada matraz de cultivo de expresión, 375 ml de material de carbenicilina filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 375 ml de material de carbenicilina filtrada estérilmente (100 mg/ml en 50% EtOH y 50% de agua ultrapura).</li>
		<li>Después de agitar para distribuir los antibióticos, tomar 2 ml del medio como muestra de referencia para la medición de densidad óptica a 600 nm (OD600).</li>
		<li>Añadir 7,5 ml del cultivo inicial al matraz de expresión e incubar durante 1 h a 37oC con 250 rpm.</li>
		<li>Después de este paso, el OD600 de cada matraz se comprobará cada 20 minutos.</li>
		<li>Cuando la densidad óptica alcanza aproximadamente 0,8, reduzca la temperatura a 16 oC e induzca la expresión de péptidos añadiendo 750 ml de 1 M de tiogalactostido de isopropil estéril (IPTG) en agua ultrapura en cada matraz de expresión.</li>
		<li>Incubar el matraz de expresión con las bacterias inducidas a 16oC durante 16 h con 250 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3: Extracción del polipéptido expresado
	<ol>
<li>Pese previamente el matraz de centrifugación para permitir la determinación de la masa del pellet celular después de la cosecha.</li>
		<li>Cosecha todas las bacterias de los matraces de expresión por centrifugación durante 20 min usando una centrífuga preenfriada a 4.000 x g y 4oC.</li>
		<li>Vierta el sobrenadante y vierta las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.</li>
		<li>Pesar los matraces de centrifugación y calcular la masa de pellets celulares.</li>
		<li>Resuspender las células, que se peletizan desde 750 ml de cultivo celular original, en 15 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4) por pipeteo, y centrífuga a 4.000 x g durante 20 min a 4 oC. Vierta el sobrenadante y vierta las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular para el paso de lisis en 2 ml de tampón por 1 gramo de pellet celular usando PBS (pH 7.4) complementado con lisozyma (1 mg/ml), 1 mM de flúor de fenilmetilonil (PMSF), 1 mM de benzamidina y 0,5 U de DNase I.</li>
		<li>Sonicar las células para una mayor lisis en el hielo con un sonicador a 8 W durante 9 min con alternando 10 s sonicación y 20 s pausando pasos, seguido de una pausa de 9 minutos durante la cual la muestra debe ser enfriada en hielo. Repita el paso de sonicación de 9 minutos una vez más.</li>
		<li>Añadir 2 ml de 10% (p/v) de polieetilemina (PEI) por 1 L de cultivo celular original para la precipitación de ácido nucleico.</li>
		<li>Distribuir la muestra en tubos centrífugos de 2 ml e incubar a 60 oC durante 10 min seguido de una incubación durante 10 min a 4 oC.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 16.000 x g durante 10 min a 4 oC y recoger el sobrenadante que contiene el ELP.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de proteínas mediante ciclo de temperatura inverso:
	<ol>
<li>Ajuste el sobrenadante a un pH de 2 para cambiar la parte hidrófila del péptido a hidrófobo e inducir la agregación. Para ajustar el pH, se utilizan ácido fosfórico e hidróxido de sodio. las franjas de pH son suficientes para determinar el nivel de pH.</li>
		<li>Para mejorar el rendimiento de la purificación de la muestra, calentar la muestra a 60 oC y añadir cloruro de sodio hasta 2 M.</li>
		<li>Posteriormente, centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a disolver el pellet en PBS (pero sólo se utiliza la mitad del volumen inicial en comparación con el paso anterior).</li>
		<li>Ajuste el pH a 7 con ácido fosfórico e hidróxido de sodio. las rayas de pH son lo suficientemente precisas para determinar el pH.</li>
		<li>Centrifugar la muestra posteriormente a 16.000 x g durante 10 min a 4oC.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante y repita los pasos 1.4.1–1.4.6 hasta 3 veces en total, excepto que en la última repetición del paso 1.4.4, solo se agrega agua en lugar de PBS.</li>
		<li>Mida la concentración de los péptidos con un espectrómetro de absorción. Utilice un coeficiente de extinción de 5500/M/cm a 280 nm.</li>
		<li>Ajustar la concentración del ELP a 700 m.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Producción de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio
<ol><li>Concentre la solución ELP a 1,1 mM utilizando un concentrador de vacío centrífugo.</li>
	<li>Mezclar 200 ml de la solución de ELP concentrada con 1.250 ml de una mezcla de cloroformo/metanol 2:1 seguida de vórtice.</li>
	<li>Añadir 1,5 g de perlas de vidrio esféricas (212–300 m de tamaño) a un matraz inferior redondo de 10 ml.</li>
	<li>Agregue la solución que contiene ELP y la mezcla de cloroformo/metanol al matraz inferior redondo y mezcle agitando suavemente.</li>
	<li>Conecte el matraz a un evaporador rotatorio. Ajuste la velocidad a 150 rpm y regule la presión a -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) durante aproximadamente 4 minutos hasta que el líquido se evapore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el matraz inferior redondo en un desecador durante al menos 1 h para asegurarse de que el cloroformo y el metanol restantes se evaporen. Para evitar la pérdida de las perlas de vidrio, papel de aluminio suelto unido debe envolverse alrededor de la abertura del matraz inferior redondo.</li>
	<li>Para un solo experimento, mezcle 100 mg de las cuentas de vidrio cubiertas de péptido con 60 ml de la solución de hinchazón, como PBS. Incubar esta muestra a 25oC durante 5 min.</li>
	<li>Centrifugar la muestra rápidamente con una centrífuga de mesa para sedimentar las cuentas de vidrio.</li>
	<li>Utilice una pipeta para recoger el sobrenadante que contiene las vesículas.</li>
</ol>3. Transcripción del ARN Aptamer dBroccoli Dentro de las Vesículas
<ol><li>Limpie el banco de laboratorio con toallitas que contienen la solución de descontaminación RNase para crear un entorno de trabajo libre de RNase.</li>
	<li>Mezclar el ssDNA (5 oM) que comprende el promotor T7 y la secuencia de dBroccoli (GAGACGGTCGGGTCCATTCGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTCGAGTAGAGTGGCGGATGTCGAGTAGGTGTC), así como la hebra no codificante (5-M) en agua libre de nucleasas suplementada con Búfer de reacción de RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH a 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM de ditiothreitol (TDT) y 2 mM de esperdinano], para preparar la plantilla de ADN para la reacción de transcripción.</li>
	<li>Incubar la solución a 90oC durante 5 min seguida de una disminución lenta de la temperatura a 20oC durante 30 min.</li>
	<li>Preparar una solución de 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) disolviendo 1.26 mg de DFHBI en 5 ml de DMSO.</li>
	<li>Preparar la reacción de transcripción mezclando el tampón de reacción de RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH a 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM de dithiothreitol (DTT), y 2 mM de esspermidina] con 125 mM de KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 M DFHBI, plantilla de ADN de 200 nM, 0.5 U/N inhibidor de la murino, y el agua.</li>
	<li>Justo antes de iniciar la reacción, añada 4 U/L T7 polimerasa.</li>
	<li>Utilice esta mezcla de reacción como la solución de hinchazón en el paso 2.7 e incubar a 37 oC durante la duración del experimento, que suele ser de 1 h.</li>
</ol>4. Transcripción-traducción (TX-TL) Reacción
NOTA: Para la reacción de transcripción-traducción, se requiere un extracto de célula bruta, así como el búfer de reacción y el ADN. El extracto de célula sordo se prepara como se describe en Sun et al.18. Para una reacción TX-TL, utilice lo siguiente: 33% (v/v) del extracto crudo de E. coli, tampón de reacción del 42% (v/v) y 25% (v/v) ADN purificado de fenol-cloroformo más aditivos. Las concentraciones finales son de aproximadamente 9 mg/ml de proteína, 50 mM DE HEPES (pH a 8), 1,5 mM de ATP, 1,5 mM DE GTP, 0,9 mM de CTP, 0,9 mM de UTP, 0,2 mg/mL de ARNm, coenzima A de 26 mM, NAD de 0,33 mM, 0,75 mM de cAMP, 68 mM de ácido foliico, 1 mmde , PEP de 30 mM, TDT de 1 mM, 2% PEG-8000, 13,3 mM de maltosa, 1 U de ARN polimerasa T7 y ADN plásmido de 50 nM en agua ultrapura.
<ol><li>
Purificación de fenol-cloroformo de la plantilla de ADN
	<ol>
<li>Preparar seis cultivos nocturnos con 5 ml de medio LB y 5 ml de solución de carbenicilina filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (100 mg/ml en 50% EtOH y 50% de agua ultrapura).</li>
		<li>Añadir una pequeña veta de un stock bacteriano prefabricado que contenga DH5 e. coli con el vector de expresión pET20b(+) a cada cultivo nocturno de 5 ml precalentado e incubar a 37 oC durante 16 h con 250 rpm. Dependiendo de qué péptido (EF) o proteína (YPet o mVenus) se va a expresar, se utiliza un plásmido de codificación específico.</li>
		<li>Extraiga el plásmido con un mini-preparación kit como se describe en el manual del usuario o siguiendo el protocolo proporcionado por Zhang et al.24.</li>
		<li>Preparar 100 l del ADN plásmido prepurificado (la concentración puede oscilar entre 200 y 600 ng/L) y mezclar con 100 l de alcohol de rotiol/cloroformo/isoamilo (pH a 7,5–8,0) en un tubo de microcentrífuga para permitir una mejor separación de fase.</li>
		<li>Invierta suavemente el tubo hasta 6x y centrífuga durante 5 min a 16.000 x g a RT.</li>
		<li>Añadir 200 ml de cloroformo a la fase superior del tubo e invertir el tubo hasta 6x.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 5 min a RT.</li>
		<li>Pipeta el sobrenadante a un tubo separado y agregue 10 éL de 3 M de acetato de sodio para la precipitación de etanol.</li>
		<li>Añadir 1 mL de etanol frío de -80oC y almacenar la muestra a -80oC durante 1 h.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 15 min a 4oC.</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y añadir 1 mL de etanol frío de -20 oC 70% (v/v).</li>
		<li>Centrífuga a 16.000 x g durante 5 min a 4oC.</li>
		<li>Retire el líquido pipeteando. Tenga cuidado de no molestar el pellet de ADN.</li>
		<li>Almacene la muestra en RT durante aproximadamente 15 minutos para evaporar el etanol restante.</li>
		<li>Añadir agua ultrapura a la muestra para ajustar la concentración de la muestra a aproximadamente 300 nM, que se mide por absorción a 260 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la reacción TX-TL
	<ol>
<li>Descongelar el extracto de células brutas preparado y el búfer de reacción en hielo.</li>
		<li>Para una mezcla de reacción de 60 l, añada el ADN plásmido (purificado de fenol-cloroformo) a 37,5 l del búfer de reacción [50 mM HEPES (pH a 8), 1,5 mM de ATP, 1,5 mM de GTP, 0,9 mM de CTP, 0,9 mM de UTP, 0,2 mg/mL de ARNm, coenzima A de 26 mM, 0,33 mM de NAD , 0,75 mM de cAMP, 68 mM de ácido flínico, 1 mM de esperdina, PEP de 30 mM, TDT de 1 mM, 2% peg-8000 y maltosa de 13,3 mM), seguido de la adición de 28,7 l de extracto de células brutas. Llene a un volumen final con agua ultrapura a 58,8 l.</li>
		<li>Justo antes de que comience la reacción, agregue 1,2 ml de la solución de polimerasa de ARN T7 y mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
		<li>Utilice esta mezcla de reacción como una solución de hinchazón en el paso 2.7 e incubar a 29 oC durante la duración del experimento, que suele ser de 4 a 8 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Conjugación de polipéptidos similares a la elastina con fluoróforos a través de azide-alkyne Huisgen Cycloaddition
<ol><li>Preparar una solución de enlace NHS-azida de 20 mM (éster N-hidroxisuccinimida de ácido azidobutírico) en DMSO.</li>
	<li>Mezclar 250 l de la solución ELP (600 m) con PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH a 7,2) y NHS-azida (1,2 mM) e incubar durante 12 horas en RT.</li>
	<li>Cargue la muestra en un casete de diálisis de 10 kDa y guárdela a 4oC durante 12 h en 1 L de agua ultrapura para eliminar las sales y el NHS-azida residual.</li>
	<li>Mezcle el ELP activado (500 m) con el tinte conjugado de alquino (500 oM), Cy5-alkyne o Cy3-alkyne.</li>
	<li>Mezclar esta muestra con 1 mM tBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxiletyl)-clorhidrato de fosfina) y 10 mM CuSO4 e incubar a 4oC durante 12 h.</li>
	<li>Cargue la muestra en un casete de diálisis de 10 kDa y guárdela a 4oC durante 12 h en 1 L de agua ultrapura, para eliminar las sales y los colorantes conjugados conjugados en alquino residual.</li>
	<li>Estos ELP modificados por tinte se utilizan en una mezcla 1:1 de los ELP etiquetados Cy3 y los ELP etiquetados Cy5 análogos a los péptidos de la segunda parte.</li>
</ol>

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<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
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<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

La rehidratación cinematográfica es un procedimiento común para la creación de pequeñas vesículas unilamellares. La principal fuente de fallo es el manejo incorrecto de los materiales utilizados en el procedimiento.

Inicialmente, los ELP son producidos por células de E. coli. El rendimiento después de la purificación de ELP puede variar significativamente dependiendo de la cuidadosa realización del protocolo durante s...

La creación de sistemas celulares sintéticos vivos se aborda generalmente desde dos direcciones diferentes. En el método de arriba hacia abajo, el genoma de una bacteria se reduce a sus componentes esenciales, lo que en última instancia conduce a una célula mínima. En el enfoque ascendente, las células artificiales se ensamblan de novo a partir de componentes moleculares o subsistemas celulares, que necesitan integrarse funcionalmente en un sistema similar a una célula consistente.
En el enfoque de novo, la compartimentación de los componentes bioquímicos necesarios se logra generalmente utilizando membranas hechas de fosfolípidos o ácidos grasos1,2,3,4. Esto se debe a que las membranas celulares "modernas" consisten principalmente en fosfolípidos, mientras que los ácidos grasos se consideran candidatos plausibles de recintos de membrana prebióticos5,6. Para la formación de nuevas membranas o para facilitar el crecimiento de la membrana, los bloques de construcción anfifílicos deben proporcionarse desde el exterior7 o idealmente a través de la producción dentro de un compartimento membranoso utilizando los procesos anabólicos correspondientes4 ,8.
Mientras que la síntesis de lípidos es un proceso metabólico relativamente complejo, los péptidos se pueden producir con bastante facilidad utilizando reacciones de expresión génica libre de células9,10. Por lo tanto, las membranas peptídicas formadas por péptidos anfifílicos representan una alternativa interesante a las membranas lipídicas como recintos para imitaciones celulares artificiales que son capaces de crecer11.
Los copolímeros dibloquealinas anfifílicas similares a dibloques (ELP) son una atractiva clase de péptidos, que pueden servir como bloque de construcción para tales membranas12. El motivo básico de secuencia de aminoácidos de ELPs es (GaGVP)n, donde "a" puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y "n" es el número de repeticiones de motivo13,14,15,16,17 . Los ELP se han creado con un bloque hidrófobo que contiene principalmente fenilalanina para un y un bloque hidrófilo compuesto principalmente de ácido glutámico11. Dependiendo de los parámetros de una y solución, como el pH y la concentración de sal, los ELP presentan una llamada transición inversa de la temperatura a temperatura Tt, donde los péptidos se someten a una transición de fase totalmente reversible de un hidrófilo a un hidrofóbico Estado. La síntesis de los péptidos se puede implementar fácilmente dentro de las vesículas utilizando el extracto de células bacterianas "TX-TL"11,18,19,20,21, que proporciona todos los componentes necesarios para la transcripción acoplada y las reacciones de traducción.
El sistema TX-TL fue encapsulado juntos, con la plantilla de ADN que codifica los ELP en vesículas ELP utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio como un soporte sólido. La formación de vesículas se produce a través de la rehidratación de los péptidos secos de la superficie del cordón11. Se pueden utilizar otros métodos22 para la formación de vesículas, que potencialmente muestran una polidispersidad más baja y tamaños de vesícula más grandes (por ejemplo, electroformación, transferencia de fase de emulsión o métodos basados en microfluídicos). Para probar la viabilidad del método de encapsulación, la transcripción del aptámero fluorogénico dBroccoli23 se puede utilizar alternativamente11,que es menos compleja que la expresión génica con el sistema TX-TL.
Debido a la expresión de los bloques de construcción de membrana en vesiculo y su posterior incorporación a la membrana, las vesículas comienzan a crecer11. La incorporación de membrana de los ELP se puede demostrar a través de un ensayo FRET. Con este fin, los ELP utilizados para la formación de la población inicial de vesículas se conjugan con colorantes fluorescentes en partes iguales que constituyen un par FRET. Tras la expresión de ELP no etiquetados en vesiculo y su incorporación a la membrana, los ELP etiquetados en la membrana se diluyen y, en consecuencia, la señal FRET disminuye11. Como método versátil y común para la conjugación, se utiliza la cicloadición de azide-alquino catalizada en cobre. Con el uso de un ligando estabilizador como tris(benzyltriazolylmethyl)-amine, la reacción se puede llevar a cabo en una solución acuosa a un pH fisiológico sin la hidrólisis de los reactivos11,que es apropiado para reacciones de conjugación péptidos.
El siguiente protocolo presenta una descripción detallada de la preparación para el cultivo de peptidosomas basados en ELP. Se describe la expresión de los péptidos y la formación de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio. Además, se describe cómo implementar la transcripción del aptámero fluorogénico de dBroccoli y la reacción de transcripción-traducción para la expresión de proteínas dentro de las vesículas ELP. Por último, se proporciona un procedimiento para la conjugación de ELP con fluoróforos, que se puede utilizar para probar el crecimiento de la vesícula a través de un ensayo FRET11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Tubo Phase Lock GelTM</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>conjugado con alcinas Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>conjugadas con alcinas Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli cepa</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Kit de ensayo de proteínas</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-isopropil tiogalactósido )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Columnas de cromatografía</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Enlazador de azida NHS (éster de oxisuccinimida de ácido y-azidobutírico)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>Bandas de pH</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>fosfóricoSigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polietileneimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Solución dibásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Solución monobásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción RNAPol</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la RNasa murino</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas RNaseZap</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-fenol/cloroformo/alcohol isoamílico</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Muestreador de aminoácidos</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis, 10k MWCO (kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Filtrado estéril (0.22 &micro; filtro m)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris(benciltriazolilmetil)amina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)-fosfina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (de E. coli)</td><td>Roche Applied Ciencia</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

en vesiculo síntesis de precursores de membrana de péptido para crecimiento de la vesícula autónoma

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

La compartimentación de las reacciones bioquímicas es un aspecto central de las células sintéticas. Para este propósito, los compartimentos de reacción basados en péptidos sirven como una alternativa atractiva a los liposomas o vesículas a base de ácidos grasos. Externamente o dentro de las vesículas, los péptidos se pueden expresar fácilmente y simplificar la síntesis de precursores de membrana. Aquí se proporciona un protocolo para la creación de vesículas con diámetros de 200 nm basados en los polipéptidos anfifílicos similares a la elastina (ELP) utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio. También se presentan los protocolos para la expresión y purificación de ELP bacteriana a través del ciclo de temperatura inversa, así como su funcionalización covalente con colorantes fluorescentes. Además, este informe describe un protocolo para permitir la transcripción del ARN aptamer dBroccoli dentro de las vesículas ELP como un ejemplo menos complejo para una reacción bioquímica. Por último, se proporciona un protocolo, que permite la expresión vesiculo de proteínas fluorescentes y el péptido de membrana, mientras que la síntesis de este último da lugar al crecimiento de la vesícula.

Producción de vesículas La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de vesículas preparadas con diferentes soluciones de hinchazón y el método de cuentas de vidrio (véase también Vogele et al.11). Para la muestra de la Figura 1A,sólo PBS se utilizó como solución de hinchazón para probar la formación de vesículas y determinar su tamaño. Cuando TX-TL se utilizó como solución de hinchazón ...

Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.

En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

En nuestro protocolo, utilizamos la rehidratación de película a partir de pequeñas cuentas de vidrio para formar compartimentos de reacción hechos de péptidos. En los experimentos, nos beneficiamos de la simplicidad y robustez del protocolo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de incorporar incluso muestras sensibles, como el extracto de célula bruta utilizado.El contacto con disolventes orgánicos afectará significativamente a la muestra. Para comenzar este procedimiento, utilice un concentrador de vacío centrífugo para concentrar la solución ELP a 1,1 mililitros. Mezclar 200 microlitros de esta solución concentrada con 1,250 microlitros de una mezcla de cloroformo y metanol de dos a uno.Vortex la solución para mezclar a fondo. A continuación, agregue 1,5 gramos de cuentas de vidrio esférico a un matraz inferior redondo de diez mililitros. Agregue la solución elP y el metanol cloroformo al matraz inferior redondo, y agite suavemente para mezclar.Conecte el matraz a un evaporador rotatorio. Ajuste la velocidad a 150 RPM y regule la presión a 20.000 pascales durante aproximadamente cuatro minutos, hasta que el líquido se evapore a temperatura ambiente. Es importante tener cuidado al usar el evaporador rotatorio debido a un posible retraso en ebullición.Después de esto, envuelva libremente la lámina de aluminio alrededor de la abertura del matraz inferior redondo para evitar la pérdida de cuentas de vidrio y coloque el matraz en un desecador durante al menos una hora, para asegurarse de que el cloroformo restante y el metanol se evaporan. Para un solo experimento, mezcle 100 miligramos de las cuentas de vidrio cubiertas por péptidos con 60 microlitros de una solución de hinchazón. Incubar esta muestra a 25 grados centígrados durante cinco minutos.Utilice una centrífuga de mesa para centrifugar las muestras rápidamente y sedimentar las cuentas de vidrio. A continuación, utilice una pipeta para recoger el sobrenadante, que contiene las vesículas. En primer lugar, mezclar 100 microlitros del ADN plásmido pre purificado con 100 microlitros de Roti-Phenol, cloroformo o alcohol isoamilo en un tubo de micro centrífuga para permitir una mejor separación de fase.Invierta suavemente el tubo hasta seis veces y centrifugar a 16.000 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo a la fase superior e invierta el tubo hasta seis veces. Centrifugar la muestra a 16.000 veces g y a temperatura ambiente durante cinco minutos.Después de esto, pipetear el sobrenadante a un tubo separado y añadir 10 microlitros de tres molares de acetato de sodio para la precipitación de etanol. Agregue un mililitro de etanol frío a 80 grados Centígrados y guárdelo a 80 grados Celsius durante una hora. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Decantar el sobrenadante y añadir un mililitro de frío 70%etanol a 20 grados Celsius. Centrifugar a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, retire el líquido pipeteando, teniendo cuidado de no molestar el pellet de ADN.Conservar la muestra a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos para evaporar el etanol restante. Después de esto, añadir agua ultra pura a la muestra para ajustar la concentración de la muestra a aproximadamente 300 nanomolares, que se mide por absorción a 260 nanómetros. Para preparar la reacción de transcripción-traducción, siga la extracción de células brutas preparadas y el búfer de reacción en el hielo.Para una mezcla de reacción de 60 microlitros, agregue el ADN plasmático a 37,5 microlitros del tampón de reacción, agregue 28,7 microlitros de extracto de células brutas y llene con agua ultra pura a un volumen final de 58,8 microlitros. Justo antes de que comience la reacción, agregue 1,2 microlitros de la solución de polimerasa T7RNA, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar la muestra y una solución de hinchazón a 29 grados centígrados durante la duración del experimento, que suele ser de cuatro a ocho horas.Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de vesículas muestran que se pueden utilizar varias soluciones de hinchazón, como TX/TL o incluso sólo PBS para formar vesículas. Para ambas soluciones, la determinación del tamaño es un paso directo. La dispersión dinámica de la luz muestra que las vesículas preparadas sin el método de las perlas de vidrio dan como resultado un diámetro de 134 nanómetros, con una polidispersidad del 25% Cuando se utilizan cuentas de vidrio, el diámetro da como resultado 168 nanómetros, con una polidispersidad del 21%La intensidad de fluorescencia de dos proteínas fluorescentes, que se expresan dentro de las vesículas ELP, se miden entonces utilizando un lector de placas de fluorescencia.Es importante tener en cuenta que después de la formación de vesículas, el contenido de las vesículas y la solución externa son los mismos, por lo tanto, el antibiótico Kanamicina se añade a la solución exterior para suprimir la expresión de proteínas. Como control, la kanamicina también se añade a la solución de hinchazón, en cuyo caso se suprime la expresión proteica dentro de la vesícula. Esto indica que la kanamicina no se difunde a través de la membrana, y suprime la expresión interna constantemente, todo el tiempo.A continuación, se realiza el ensayo FRET para demostrar la incorporación de ELP en la membrana. Tras la expresión de los ELP de membrana, los péptidos adicionales se incorporan a la membrana, lo que aumenta la distancia media entre los pares fret, y que resulta en un aumento de la señal del donante. La técnica presentada se puede utilizar para producir recipientes de reacción simples o para crear células artificiales con membranas basadas en péptidos.El contenido interior se puede elegir según sea necesario. Mediante el uso de estas vesículas péptidos, ahora podemos mirar hacia adelante en reacciones de síntesis más complejas dentro de ellos.

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Bioingeniería

Este protocolo de detalles un método para la medición cuantitativa de la translocación de péptidos en grandes vesículas de lípidos unilamelares. Este método también proporciona información sobre la tasa de translocación de membrana y puede ser utilizado para identificar péptidos que de manera eficiente y espontáneamente bicapas lipídicas cruz.

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Hemos sintetizado nanoestrellas en forma de estrella de oro con una mediada de plata de semillas método de crecimiento. El diámetro de la nanoestrellas oscila entre 200 y 300 nm y el número de consejos varían de 7 a 10. Las nanopartículas tienen una superficie amplia de plasmones modo de resonancia centrada en el infrarrojo cercano.

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