Name: Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende a producir proteínas tipo elastina como hidrogeles ajustables para encapsulación celular en 3D y técnicas de inmunotinción. Este método permite estudiar interacciones célula-matriz extracelular en biomateriales.

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Los autores agradecen T. Palmer y H. Babu (Neurocirugía de Stanford) para proporcionar murino NPCs. Vector art en la figura 4 fue utilizado y adaptado de Servier arte médico bajo licencia Creative Commons Atribución 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte de este trabajo fue realizado en la Stanford Nano comparte instalaciones (FNS), apoyado por la National Science Foundation bajo premio ECCS-1542152. N.A.S. agradece apoyo del Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud (32GM 008412). C.M.M. reconoce apoyo de un NIH NRSA becas predoctorales (F31 EB020502) y el programa Siebel. S.C.H. reconoce apoyo de los institutos nacionales de salud (U19 AI116484 y R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) y el Instituto de California de medicina regenerativa (RT3-07948). Esta investigación recibió financiamiento de la Alianza para la investigación Regenerativa de rehabilitación y capacitación (AR3T), que es apoyada por la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD), Instituto Nacional de Desórdenes neurológicos y movimiento (NINDS) e Instituto Nacional de imágenes biomédicas y bioingeniería (NIBIB) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P2CHD086843. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los institutos nacionales de salud.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Purificación y expresión de la proteína recombinante es una herramienta poderosa para sintetizar biomateriales con alta reproducibilidad. Debido en gran parte a la llegada de la clonación molecular comercializada, plásmidos recombinantes personalizados pueden adquirirse de varios proveedores, que reduce significativamente el tiempo para trabajar con materiales como el ELPs. Del mismo modo, plásmidos pueden solicitarse directamente en el laboratorio de origen, cuando la obra original fue respaldada por un contrato federal...

Durante el siglo pasado, cultivo de tejidos de dos dimensiones (2D) se ha convertido en un conjunto de herramientas integral para el estudio de biología fundamental de la célula en vitro. Además, los protocolos relativamente barato y simple para el cultivo celular 2D han conducido a su adopción a través de muchas disciplinas biológicas y médicas. Sin embargo, más allá de la investigación ha demostrado que las plataformas 2D tradicionales pueden conducir a resultados que se desvían marcadamente de los recogidos en vivo, causando tiempo precioso y financiación en vano para la investigación clínico1,2, 3. Nosotros y otros presumen que esta discrepancia puede ser atribuida a la falta de nativos señales bioquímicas y biofísicas a las células cultivadas en las superficies de la 2D, que pueden ser necesarias para la óptima proliferación y maduración de diversos tipos celulares.
Para hacer frente a estas limitaciones y ayuda el puente de la brecha entre 2D estudios in vitro e in vivo , los investigadores tienen plataformas de hidrogel (3D) tridimensional desarrollado para la encapsulación de la célula1,4,5 ,6. Los hidrogeles son materiales ideales para recapitular el microambiente endógeno de la matriz extracelular (ECM) en vivo debido a sus propiedades mecánicas como de tejido y estructura hinchada de agua que permite el rápido transporte de nutrientes y señalización de factores de7,8. Además, 3D hidrogeles pueden diseñarse para tener control independiente sobre las propiedades mecánicas y bioquímicas del andamio. Matriz mecánica9,10,11,12 y ligandos de células adhesivas13,14,15 son bien sabido para influir en la célula comportamiento en vitro y en vivo. Así, los hidrogeles 3D con propiedades ajustables ofrecen una plataforma para estudiar las relaciones de causalidad entre las células y su microambiente. Criterios para una matriz hidrogel 3D ideal incluyen encapsulación de células simple, no citotóxica como independiente afinabilidad de fisiológicamente relevantes propiedades mecánicas e imitadores de motivos adhesivo celular nativos.
Tanto sintético (e.g., polietilenglicol, ácido poliláctico, poli (ácido glicólico)) y origen natural (por ej., alginato, colágeno, Matrigel) hidrogeles tienen ventajas sobre las plataformas de cultura 2D en vitro ; sin embargo, también tienen importantes deficiencias que limitan su aplicabilidad. Primero, muchas plataformas sintéticas y de origen natural requieren condiciones de reticulación áspero que pueden ser potencialmente tóxicas para las células mamíferas, conduce a disminución de la viabilidad de la célula7. Además, muchas plataformas sintéticas carecen de actividad biológica nativa y deban ser funcionalizados mediante reacciones químicas secundarias, que pueden agregar mayor complejidad y costo16. Finalmente, mientras que los materiales de origen natural contienen típicamente intrínsecos dominios bio-activo, a menudo se ven afectadas por la alta variabilidad de lote a lote y a menudo se limitan a formar geles relativamente débil7,17.
Ingeniería de proteínas recombinantes presenta un conjunto único de herramientas para el diseño de materiales por lo que permite el control explícito de secuencia de la proteína y, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de hidrogel final andamio18. Además, aprovechando la maquinaria biológica conocida de Escherichia coli (e. coli) para expresar proteínas materiales pueden producir rentable y consistente con variabilidad limitada inter y intra-lote. La proteína elastina-como (ELP) presentada aquí tiene tres dominios modificados: (1) una etiqueta T7 y His6 que permite mediante fluorescencia de etiquetado etiquetado anticuerpos, (2) una región de 'elastina-como' que le confiere propiedades mecánicas elásticas y permite para química reticulación y (3) una región de 'bio-activo' que codifica para celular-adhesivo motivos.
Nuestra región de elastina-como se basa en la canónica (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) secuencia de elastina5 donde cuatro de lo Xaa sitios del aminoácido isoleucina (Ile), pero podrían ser diseñado para ser cualquier aminoácido, excepto prolina. Esta secuencia dota ELPs recombinantes con bajo comportamiento de temperatura (LCST) de solución crítica que pueden ser aprovechados para la expresión posterior purificación simple vía termal ciclismo19,20. Esta propiedad LCST puede ajustarse al agregado térmicamente a diferentes temperaturas modificando el huésped 'Xaa' residuo21,22.
Aquí, la posición de 'Xaa' en una de las cinco repeticiones de elastina-como ha sido reemplazada con el presentación de Amina lisina (Lys) aminoácido, que se utiliza para la reticulación de hidrogel. Nuestro trabajo previo ha demostrado no citotóxico y robusto reticulación vía la reacción con los reactivos amina crosslinker tetrakis (hidroximetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Variables proteína contenido y crosslinker concentración total, somos capaces de producir hidrogeles que pueden ajustarse para abarcar un rigidez fisiológicamente relevante gama (~0.5-50 kPa)9,23,24. Además de afinar características mecánicas, adhesión celular dentro del hidrogel resulta de la integración de dominios de células adhesivas canónicos dentro de la columna vertebral de la proteína de la ELP. Por ejemplo, la incorporación de la secuencia de aminoácidos derivados de fibronectina extendida 'RGDS' permite la adhesión celular y flexibilidad conformacional, mientras los revueltos, variante de 'RDGS' no vinculante restringe de adhesión célula-matriz24. Modulando la relación de la célula-adhesivo para proteínas no-adhesiva, así como la concentración de proteína total, somos capaces de producir efectivamente hidrogeles que abarcan una amplia gama de la concentración de ligando. Consecuencia, hemos desarrollado una plataforma de hidrogel con propiedades bioquímicas y biofísicas desconectadas, que pueden ajustarse independientemente para una óptima cultura 3D de diversos tipos celulares.
Además de rigidez de la matriz y afinabilidad ligando adhesivo, hidrogeles recombinantes ofrecen la capacidad de diseño perfiles de degradación del material específico, que es necesaria para separarse de la célula, la proliferación y la migración dentro de un contexto 3D4 , 9. esta degradación es ofrecida por secreción celular de las proteasas que dirigidas específicamente prolongado 'RGDS'9 o elastina-como secuencia25. Hidrogeles ELP también han demostrado para los posteriores ensayos bioquímicos que son necesarios para el estudio de viabilidad celular y la función incluyendo immunocytochemistry, así como la extracción de ADN/ARN/proteína para reversa cuantitativa reacción en cadena de la transcripción-polimerasa (qRT-PCR) y Western blot9. ELP variantes también se han utilizado en un número de modelos en vivo y son conocidas por ser bien tolerado por el sistema inmune26.
Tomados en conjunto, ELP como una plataforma material para estudios de encapsulación celular cuenta con una amplia variedad de ventajas en comparación con plataformas de material sintético o de origen natural, que carecen a menudo el mismo grado de afinabilidad bioquímica y Biofísica y reproducibilidad. Además, no citotóxico un de ELP uso sencillo y con una gran variedad de tipos celulares (por ej., chick raíz dorsal ganglia14,24, progenitoras neurales murinos células9,27, bovina de las células troncales mesenquimales humanas condrocitos neonatal28, human endothelial células29,30) permite que un modelo más fisiológicamente relevante del endógeno ECM 3D en comparación con el cultivo celular 2D. Adjunto, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante, TEKS para el uso como plataforma de hidrogel regulables para 3D encapsulación de la célula. Además presentamos la metodología para el down-stream fluorescente etiquetado y microscopia confocal de células encapsuladas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Expresión y purificación de proteínas similares a la elastina</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Células Competentes</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal disódica, dihidratada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa (0.22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Excelente Caldo</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtros de jeringa</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>lámina de silicona de 0,5 mm de espesor</td><td>Electrónica Microscopy Science</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Punzón de biopsia desechable</td><td>Corning 353047</td><td></td></tr><tr><td>(2 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia desechable (4 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia desechable (5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' solución salina tamponada con fosfato (DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Nº 1 cubreobjetos de vidrio de 12 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Inmunocitoquímica de células en hidrogeles ELP 3D</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (p/v) Paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Sondas moleculares</td><td>D1306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra (AF488)</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (AF546)</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario de nestina de ratón</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Sox2 Tecnología de señalización celular de anticuerpos primarios</td><td></td><td>23064S</td> Esmalte de <td></td></tr><tr><td>uñas</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Medio de montaje&nbsp;</td><td>Laboratorios Vectoriales</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el immunostaining de células en 3d

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Técnicas bidimensionales (2D) cultivo de tejidos han sido esenciales para nuestra comprensión de la biología de la célula fundamental. Sin embargo, la falta de sistemas de cultura de tejido tradicional 2D una matriz (3D) tridimensional, dando como resultado una importante desconexión entre resultados obtenida in vitro e in vivo. Para solucionar esta limitación, los investigadores han diseñado plataformas de cultivo de tejidos de hidrogel 3D que pueden imitar las propiedades bioquímicas y biofísicas del microambiente de la célula en vivo . Esta investigación ha motivado la necesidad de desarrollar plataformas de material que soportan encapsulación celular 3D y posteriores ensayos bioquímicos. Ingeniería de proteínas recombinantes ofrece un único conjunto de herramientas para desarrollo y diseño de material de hidrogel 3D por lo que permite el control específico de la secuencia de la proteína y por lo tanto, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de la resultante matriz. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante como elastina proteína (ELP), que puede utilizarse para forma hidrogeles con propiedades mecánicas independientemente ajustables y la concentración de ligando adhesivo celular. Además presentamos una metodología para la encapsulación de la célula en hidrogeles ELP y posterior tinción inmunofluorescente de encajado las células para posteriores análisis y cuantificación.

El ELPs utilizados en este protocolo se componen de cinco regiones: una etiqueta de T7, etiqueta His6, sitio de la hendidura del enterokinase (EK), una región de bio-activos y una región de elastina-como (figura 1). Las etiquetas T7 y His6 permiten la fácil identificación mediante técnicas de Western blot estándar. Introducción del sitio de clivaje EK permite la eliminación enzimática de la región de la etiqueta, si es necesario. La región de bio-activos codi...

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

El objetivo general de este protocolo es expresar y purificar proteínas similares a la elastina derivadas de la recombinante para su uso como hidrogel sintonizable para la encapsulación celular en 3D. Además, este protocolo presenta la metodología para el marcaje fluorescente posterior en microscopía confocal de células encapsuladas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave dentro de los campos de los biomateriales, la medicina regenerativa y la biología celular, como la comprensión del papel de las interacciones entre la célula y la matriz extracelular en 3D.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una plataforma de material reproducible, ajustable y modular que es susceptible de estudio de múltiples tipos de células. En general, la implementación de esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de los parámetros críticos de señalización de la MEC celular que pueden dictar el éxito de futuras terapias regenerativas basadas en células. Raye una placa de agar ampicilina y cloranfenicol con un stock bacteriano prefabricado que contenga un vector que codifica para el ELP de interés.Luego, incube la placa rayada boca abajo a 37 grados centígrados durante la

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

Este vídeo muestra una técnica para inmunotinción de células encapsuladas en un hidrogel 3D. El cultivo de hidrogel que contiene células progenitoras neurales se fija, se permeabiliza y se trata con una solución bloqueante para evitar la inmunotinción inespecífica. Se añade un cóctel de anticuerpos primarios para unirse a proteínas específicas, seguido de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia y una tinción nuclear. A continuación, la muestra se monta en un portaobjetos y se observa...

Inmunotinción de células encapsuladas en un sistema de hidrogel 3D

El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

El procesamiento por cizallamiento durante la formación de hidrogel da como resultado la producción de suspensiones de microgel que se adelgazan pero se reestructuran rápidamente después de la eliminación de las fuerzas de cizallamiento. Tales materiales se han utilizado como una matriz de soporte para bioimpresión compleja, estructuras cargadas de células. Aquí se describen los métodos utilizados para fabricar la cama de soporte y las biotintas compatibles.

Geles fluidos de agarosa formados por procesamiento de cizallamiento durante la gelificación para bioimpresión 3D suspendida

Este artículo describe cómo bioimprimir hidrogeles fotoajustables en 3D para estudiar el endurecimiento de la matriz extracelular y la activación de fibroblastos.

Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

Aunque la rigidez de la matriz extracelular (MEC) es un regulador clave del comportamiento celular, los mecanismos subyacentes de detección y transducción siguen siendo poco claros. Para abordar esto, proporcionamos protocolos para crear sustratos a base de poliacrilamida y silicona con rigidez ajustable para avanzar en nuestra comprensión de la diafonía célula-ECM.

Generación de sustratos de matriz extracelular de poliacrilamida y silicona con rigidez definida para aplicaciones en biología celular

Aprende a producir proteínas tipo elastina como hidrogeles ajustables para encapsulación celular en 3D y técnicas de inmunotinción. Este método permite estudiar interacciones célula-matriz extracelular en biomateriales.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

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