Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

El objetivo general de este protocolo es expresar y purificar proteínas similares a la elastina derivadas de la recombinante para su uso como hidrogel sintonizable para la encapsulación celular en 3D. Además, este protocolo presenta la metodología para el marcaje fluorescente posterior en microscopía confocal de células encapsuladas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave dentro de los campos de los biomateriales, la medicina regenerativa y la biología celular, como la comprensión del papel de las interacciones entre la célula y la matriz extracelular en 3D.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una plataforma de material reproducible, ajustable y modular que es susceptible de estudio de múltiples tipos de células. En general, la implementación de esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de los parámetros críticos de señalización de la MEC celular que pueden dictar el éxito de futuras terapias regenerativas basadas en células. Raye una placa de agar ampicilina y cloranfenicol con un stock bacteriano prefabricado que contenga un vector que codifica para el ELP de interés.

Luego, incube la placa rayada boca abajo a 37 grados centígrados durante la noche para permitir el crecimiento bacteriano. Al día siguiente, elija una sola colonia del plato e inocule el cultivo iniciador precalentado. Incubar el cultivo en una coctelera a 37 grados centígrados durante 16 horas.

Una vez finalizado el periodo de incubación, utilizar una pipeta serológica para transferir 20 mililitros del cultivo iniciador a cada matraz de extracción. Deje agitar el matraz de expresión durante una hora. Después de una hora, mida la densidad óptica a 600 nanómetros de una alícuota del matraz de expresión.

Tan pronto como la lectura llegue a 0,6, reduzca la temperatura del agitador a 32 grados centígrados. Cuando la lectura llegue a 0,8, agregue un mililitro de un molar de IPTG filtrado estéril para inducir la expresión de ELP en el matraz de expresión. Permita que la cultura se exprese durante siete horas.

Después de siete horas, centrifugar el medio de expresión a 12.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga de suelo. Después de la centrifugación, use una espátula para recoger el pellet de celda del contenedor de centrífuga y colóquelo en una bolsa ziploc prepesada. A continuación, disuelva el gránulo de celda en un tampón TEN filtrado estéril.

Masajee el pellet de células para formar una solución homogénea. Congele la bolsa ziploc con pellet de celda resuspendida en un recipiente secundario a 80 grados centígrados. Al pellet de células descongeladas, agregue aproximadamente de 30 a 40 miligramos de desoxirribonucleasa y un mililitro de PMSF 100 milimolar por cada 100 mililitros de lisado celular.

Incubar el lisado a cuatro grados centígrados en una coctelera durante la noche. Después del tercer ciclo de congelación-descongelación, centrifugar las muestras a una temperatura mínima de 15.000 x g durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante del recipiente de centrífuga y transfiera la solución a un nuevo recipiente de centrífuga.

A cada 100 mililitros de sobrenadante, agregue 5,84 gramos de cloruro de sodio en tres partes hasta una concentración final de un molar. Incubar la suspensión en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de la incubación, centrifugar las muestras a una temperatura mínima de 15.000 x g durante una hora a 37 grados centígrados.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante del recipiente de la centrífuga y macee el pellet. A continuación, agregue 10 mililitros de agua ultrapura esterilizada en autoclave por gramo de pellet obtenido después de la centrifugación. Para asegurarse de que la proteína se disuelva por completo, use una espátula de metal para triturar y resuspender el pellet.

Incubar el pellet resuspendido a cuatro grados centígrados durante la noche en un agitador orbital. Repita los pasos de centrifugación en frío y en caliente durante un total de tres ciclos para purificar aún más el ELP. A continuación, marque el sobrenadante residual en una membrana de diálisis de 3,5 kilodalton contra cuatro litros de agua ultrapura preenfriada a cuatro grados centígrados durante tres días para desalar la solución proteica.

Centrifugar la solución dializada final en una centrífuga preenfriada. Congele el sobrenadante a 80 grados centígrados en un tubo cónico previamente pesado. Finalmente, liofilizar la solución congelada durante tres días y luego pesar el producto liofilizado final para determinar el rendimiento de proteína.

Con la ayuda de un punzón de biopsia, cree agujeros en una lámina de silicona de 0,5 milímetros de grosor. Luego corta un cuadrado alrededor de cada agujero. A continuación, use pinzas para quitar la envoltura de plástico a cada lado de los moldes individuales.

Después de quitar la envoltura de plástico, use las pinzas para colocar el número idéntico de moldes de silicona desnudos y deslizamientos de cubierta de vidrio en filas alternas en la tapa de una placa de 48 pocillos para la posterior unión por plasma. Una vez que se han fabricado todos los materiales de cultivo celular, puede comenzar la preparación del tipo de célula de interés para la encapsulación de hidrogel aguas abajo. Después de disociar las células en una suspensión de una sola célula, alícuota el número deseado de células en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugar las células a aproximadamente 200 x g durante tres minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y almacene el pellet en hielo. Vuelva a suspender el pellet de celda en la solución madre ELP hasta el 80% del volumen final.

A continuación, utilice una pipeta para mezclar la solución en una suspensión homogénea de células en ELP. Para el 20% restante del volumen final, agregue la solución madre de THPC a la suspensión de ELP de celda. Pipetear varias veces para asegurar la formación de una mezcla homogénea, evitando la formación de burbujas de aire.

A continuación, con un movimiento circular, pipetee la mezcla de THPC ELP de celda en cada molde en una placa de 24 pocillos. A continuación, incube las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, incube las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos más.

Una vez finalizada la incubación, agregue con cuidado 750 microlitros de medio de cultivo celular tibio a cada pocillo en una placa de 24 pocillos. Deje el hidrogel a 37 grados centígrados durante el tiempo de cultivo deseado. Primero, aspire el medio de cada pocillo.

A continuación, lave los pocillos con un mililitro de DPBS tibio. Una vez completado el lavado, agregue 750 microlitros de solución de fijación a cada pocillo. Luego, incube la placa de 24 pocillos a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de la incubación, aspire la solución de fijación de cada uno de los pocillos y deseche el fijador en un contenedor de residuos peligrosos. A continuación, agregue un mililitro de DPBS a la muestra e inmediatamente deseche el DPBS en un contenedor de desechos peligrosos. A continuación, agregue 750 microlitros de solución de permeabilización para permeabilizar la muestra durante una hora a temperatura ambiente en el balancín a 15 revoluciones por minuto.

Después de una hora, aspire la solución de permeabilización y agregue 750 microlitros de solución de bloqueo a la muestra. Deje la muestra en el balancín a temperatura ambiente durante tres horas. A continuación, diluya los anticuerpos primarios deseados con la solución de dilución de anticuerpos.

A continuación, añada 500 microlitros de la solución de anticuerpos a cada muestra. Incubar las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, aspire la solución de anticuerpo primario, luego lave las muestras con PBST durante una hora tres veces a temperatura ambiente a 15 revoluciones por minuto.

A continuación, diluya los anticuerpos secundarios apropiados en cinco miligramos por mililitro de solución madre de DAPI para lograr una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro. Luego, agregue 500 microlitros de la solución a cada muestra. A continuación, use papel de aluminio para cubrir la placa de 24 pocillos e incube la placa a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave las muestras con PBST tres veces cada una durante 30 minutos a temperatura ambiente en un balancín. A continuación, coloque una gota de medio de montaje rígido en la superficie de un portaobjetos de vidrio y coloque la muestra en el medio de montaje. Finalmente, use esmalte de uñas para sellar las muestras al portaobjetos de la cubierta de vidrio para evitar la contaminación o el movimiento de la muestra.

Aquí, la expresión de la proteína diana con el ELP de longitud completa en condiciones controladas se valida mediante la presencia de bandas a 37 kilodaltons tanto en el análisis SDS-PAGE como en el análisis de Western blot. Sin embargo, en condiciones no controladas, varias bandas de bajo peso molecular también son visibles mediante Western blot. Las bandas de menor peso molecular corresponden a proteínas con menos de cuatro repeticiones de dominio tipo elastina, lo que indica que la proteína no se traduce completamente durante la expresión.

Este resultado es común cuando se realiza la expresión por encima de los 32 grados centígrados. Para variar la concentración del ligando adhesivo celular mientras se mantienen constantes las propiedades mecánicas del hidrogel, se ajusta la proporción de la variante ELP que contiene el adhesivo celular derivado de la fibronectina y las secuencias adhesivas no celulares. Además, las células progenitoras neurales murinas también son viables durante un período de siete días cuando se encapsulan en un hidrogel al 3% de ELP.

Las células vivas se identifican en verde debido a la tinción de calceína AM, mientras que el homodímero de etidio rojo es absorbido preferentemente por las células muertas. Para validar el fenotipo de las células madre de las células progenitoras neurales, la expresión de marcadores canónicos como Sox2 y nestina también se visualiza mediante inmunotinción cuando las células se encapsulan en los hidrogeles ELP 3D. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo expresar y purificar proteínas similares a la elastina para la encapsulación posterior de varios tipos de células y, además, investigar el papel del microambiente 3D en la modulación del fenotipo celular.