Summary
Questo protocollo descrive un microfluidica co-coltura modello per la cultura contemporanea e localizzato delle cellule epiteliali e batteri. Questo modello può essere utilizzato per indagare il ruolo dei diversi segnali solubili molecolare sulla patogenesi e schermo l'efficacia del putativo ceppi batterici probiotici.
Abstract
L'essere umano gastrointestinale (GI) è un ambiente unico in cui cellule epiteliali intestinali e non patogeni (commensale) batteri coesistono. E 'stato proposto che il microambiente che il patogeno incontra nello strato commensali è importante per determinare l'entità della colonizzazione. Metodi di coltura per lo studio attuale colonizzazione dei patogeni non sono adatti per indagare questa ipotesi in quanto non consentono di co-coltura di batteri e cellule epiteliali in un modo che simula il microambiente del tratto gastrointestinale. Qui descriviamo una microfluidica co-coltura modello che consente la cultura indipendente delle cellule eucariotiche e batteri, e testare l'effetto del microambiente commensale sulla colonizzazione dei patogeni. La co-coltura modello è dimostrato attraverso lo sviluppo di un commensale
Protocol
1. Fabbricazione di maestri silicio utilizzando le normali SU-8 fotolitografia 1 (non mostrato in questo video).
- Uso standard SU-8 metodi di fotolitografia per creare un SU-8 "maestri" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) per la realizzazione delle diverse componenti (membrane PDMS di diverso spessore, co-coltura da camera) in una camera sterile. Stampi maestro tale può essere fabbricato in qualunque impianto di microfabbricazione (ad esempio, Stanford Microfluidica Fonderia; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Prima della replica PDMS, esporre il SU-8 maestri fluorosilane a vapore in un essiccatore collegato a una fonte di vuoto per facilitare la liberazione facile PDMS dal master. Aggiungere una goccia di fluorosilane ad un tovagliolo di carta e si applicano a vuoto per un min. Rimuovere il vuoto e attendere 30 minuti per la deposizione di fluorosilane. Tenere il SU-8 master in un contenitore chiuso per un uso futuro.
2. Stampaggio replica del PDMS da SU-8 master 2
- Lo strato fluidico e il livello di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS da SU-8 master.
- Miscelare il PDMS pre-polimero e cross-linker ad un peso 10:1. rapporto e Degas in un essiccatore per 1 ora (o fino a quando le bolle d'aria vengono rimossi dalla miscela PDMS).
- Posizionare il SU-8 master in una capsula di Petri e con attenzione versare il composto PDMS sulla parte superiore del SU-8 master. Degassare la PDMS di nuovo.
- Spin lo stampo a 1200 rpm per un minuto per ottenere uno spessore uniforme di circa 100μm PDMS sullo stampo.
- Riscaldare la capsula di Petri contenente il PDMS e il SU-8 stampo maestro a 80 ° C per un'ora per curare il PDMS.
- Rimuovere il curato PDMS coperto SU-8 maestro dalla piastra.
- Sbucciare lo stampo PDMS dal SU-8 master.
- Praticare quattro fori nello stampo PDMS con un calibro 20 ago smussato-end per due ingressi batteri, una presa e una porta pneumatica.
3. Incollaggio di multistrato dispositivi PDMS: Questo dispositivo è assemblato con tre strati, uno strato superiore che contiene il canale principale, uno strato pneumatico medio, e uno strato inferiore di batteri che contiene i canali per i batteri. I tre strati sono assemblati come descritto di seguito.
- Bagnare le membrane PDMS con metanolo e con attenzione pelarle dalla loro SU-8 stampo master utilizzando una pinza pulita. Membrana posto su un foglio di teflon.
- Posizionare la membrana pneumatica e lo strato di fluido in una camera di plasma di ossigeno. Accendere il plasma per 40 sec (ossigeno pressione 10 SCCM, 100W di potenza RF).
- Dopo l'esposizione al plasma, allineare (entro 10 minuti) la membrana sul fondo PDMS canale utilizzando pinze. L'aggiunta di metanolo sulla membrana e gli strati PDMS aiuta la libera circolazione degli strati, e rende più facile l'allineamento. In questo caso, il dispositivo è posizionato su un pezzo di garza per consentire la fuga di vapori di metanolo.
- Curare gli strati PDMS allineati su una piastra a 80 ° C per 8 ore
- Dopo l'incollaggio della membrana pneumatica sullo strato inferiore, ripetere i passaggi 3,2-3,4 per legare il canale in alto sul dispositivo montato composito PDMS.
4. Montaggio del dispositivo PDMS 3,4
- Praticare dei fori nei porti di ingresso e di uscita utilizzati per la semina delle cellule eucariotiche e batteri.
- Collegare il tubo Tygon (0,01 pollici OD) per le porte e far funzionare lo strato pneumatico tirando con una siringa da 20 mL.
- Posizionare il modello PDMS e una lastra di vetro pre-lavaggio in una camera di plasma di ossigeno. Accendere il plasma per 20 secondi (pressione di ossigeno 20 SCCM, RF di potenza 300W) senza applicare il vuoto.
- Al fine di evitare il contatto tra la parete dell'isola (PDMS) l'adesione al vetrino, immediatamente collegare una siringa al dispositivo e applicare vuoto tirando la siringa e tenerlo in posizione.
- Premere delicatamente il modello PDMS sul vetro (entro 2 minuti).
- Curare il dispositivo PDMS a 80 ° C per 10 minuti.
5. Trattare la superficie di vetro con fibronectina
- Sterilizzare dispositivo ai raggi UV per 15 minuti dopo il collegamento di tubi Tygon ad ogni porta.
- Compilare e il flusso del sterilizzati PBS nel canale per rimuovere i detriti nel canale. Applicare flusso per 10 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Le bolle d'aria può facilmente sfuggire al PDMS a causa della sua permeabilità ai gas.
- Riempire un soluzione colorante colore nel canale pneumatico per prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale.
- Per facilitare la semina delle cellule eucariotiche sul vetro, introdurre un 1 mg / ml soluzione della fibronectina nel dispositivo e incubare per 40 minuti a 37 ° C.
- Lavare la fibronectina in eccesso con 1 ml di terreni di crescita.
6. Formazione e misura di commensali E. coli in biofilmisole
- Diluire i batteri commensali (ad esempio, E. coli BW25113/pCM18) nei media M9 minimo diametro esterno 600 ~ 1 per formare un biofilm commensale in camere chiuse / isole.
- Chiudere il muro isola applicando positiva-liquido pressione. Un fatto in casa aria-liquido convertitore di pressione viene utilizzato per prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale.
- Introdurre il commensale E. coli nelle isole con la valvola chiusa, e permettere ai batteri di attaccare per 1 ora a 32 ° C.
- Lavare i batteri distaccato e profumato una sospensione batterica diluita (OD 600 ~ 0,05) a 0.25mL/hr per 12 ore.
- Sciacquare il biofilm con freschi terreni di coltura DMEM per rimuovere i batteri vagamente-attached e prepararsi per il fissaggio delle cellule eucariotiche.
- Immagine del biofilm utilizzando una Leica TCS SP5 microscopio confocale a scansione laser (Bannockburn, IL), e visualizzare l'architettura biofilm utilizzando il software IMARIS 5.
7. Semina cellule eucariotiche intorno alle isole batteriche 6-8
- Trypsinize cellule HeLa dal fiasco del tessuto culturale e risospendere in DMEM media per una densità di semina di 5 x 10 5 cellule / ml.
- Introdurre cellule HeLa nel dispositivo ad un flusso di 2 mL / min con una pompa a siringa Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Assicurarsi che il muro isola è abbassato in modo che il biofilm batterico è separato dalla regione delle cellule HeLa. Questa operazione deve essere eseguita sul palco di un microscopio ottico in modo che l'uniformità di semina può essere determinato.
- Fissare la presa cellula per ridurre il movimento della sospensione cellulare nel canale e incubare per 6 ore a 37 ° C in un 5% di CO 2 incubatore.
- Profumato il dispositivo con mezzo di crescita a 0,5 ml / ora per rimuovere le cellule senza legami.
- Aggiornare i media DMEM per HeLa e commensali E. coli ogni 6 ore.
8. Introduzione di batteri patogeni nell'isola e l'esposizione delle cellule eucariotiche
- Preparare E. coli O157: H7 (EHEC) per infettare le cellule HeLa in una molteplicità di infezione (moi) di 100:1 200:1 (numero di EHEC per cellula HeLa).
- Sciacquare e lavare i batteri commensali liberamente iscritti.
- Introdurre una sospensione diluita EHEC (OD 600 ~ 0,1) nelle isole.
- Incubare dispositivo a 37 ° C in un 5% di CO 2 incubatore per 6 ore senza flusso per consentire EHEC di essere esposti a segnali presenti nel biofilm commensale.
- Sollevare il muro PDMS per esporre EHEC nelle isole commensale di cellule HeLa per 6 ore.
- Sciacquare il canale con PBS e colorare per le cellule vive e morte con il kit Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA).
- Posizioni di immagini su un microscopio a fluorescenza Zeiss Axiovert 200M e stimare il numero di cellule vive e morte.
9. Risultati Rappresentante 9
La sequenza di eventi nelle infezioni del tratto gastrointestinale è stato imitato con lo sviluppo di un monostrato di cellule HeLa e un commensale E. coli biofilm ed esponendo EHEC al biofilm commensale prima infezione di cellule HeLa. I passi necessari per la fabbricazione della microfluidica co-coltura modello sono mostrati in figura 1. Figura 2A mostra un 3-dimensionale prestazione del co-coltura dispositivo. Le due regioni in co-coltura dispositivo della camera di coltura delle cellule eucariotiche e l'isola batterica sono mostrati in figura 2B con coloranti diversi colori (viola per le regioni degli eucarioti e verde per l'isola batterica). La fattibilità di isolare le regioni coltura batterica dalla regione circostante eucariote è mostrato nella figura 2C utilizzando coloranti colori. Figura 3 mostra i risultati rappresentante di co-coltura delle cellule epiteliali e batteri. 3A figura mostra colonizzazione del biofilm commensale (verde) isola EHEC (rosso). Figura 3B mostra la giustapposizione di cellule epiteliali e commensali E. coli con EHEC nell'isola batterica. Il RFP esprimendo EHEC e batteri che esprimono GFP commensali sono localizzati nell'isola quando la parete PDMS si abbassa, che illustrano la fattibilità di isolare l'isola batterica da cellule epiteliali.
Figura 1: schema di semina cella nel modello di co-cultura. (1) Il muro PDMS si abbassa a formare un'isola, batteri commensali sono introdotti nel l'isola, e fibronectina è scorreva intorno all'isola. (2) le cellule HeLa sono seminate nelle regioni che circondano l'isola. (3) Dopo cellule HeLa raggiungere la confluenza e il biofilm commensale si è sviluppata, EHEC viene introdotto l'isola. (4) Il muro PDMS è sollevatofino a esporre le cellule HeLa che circondano l'isola di EHEC. Inserto mostra i dettagli del funzionamento della valvola.
Figura 2: modello Microfluidic per la co-coltura delle cellule epiteliali e batteri. (A) tridimensionale resa dei co-cultura dispositivo che indica le regioni cattura pneumatico-attuato per la formazione di isole batteriche tra le cellule epiteliali. Ogni isola batterica (1200 micron di diametro e 1000 micron a parte) ha un ingresso separato e uscita per la fornitura di mezzi di comunicazione la crescita e la rimozione dei rifiuti dall'isola. (B) Micrografia della co-coltura dispositivo con coloranti a colori che mostrano le diverse regioni (zona delle cellule epiteliali, isole batterica). (C) La fedeltà del sistema di cattura pneumatico è mostrato abbassando il muro PDMS (pannello di sinistra), utilizzando un pneumatico attivato canale (blu), l'introduzione di porpora nelle isole chiuso dell'isola, e che scorre colorante giallo intorno ad esso per 48 h. Quando il muro si alza PDMS (pannello di destra), la regione insulare è esposto al colorante giallo circostante. Barra di scala rappresenta 500 micron.
Figura 3: Co-coltura di cellule HeLa e batteri. (A) immagine di fluorescenza di RFP che esprimono EHEC e GFP che esprimono E. coli BW25113 in isola. (B) Sovrapposizione di trasmissione, verde e rosso immagini di fluorescenza nel dispositivo. Barra di scala rappresenta 200 micron.
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Discussion
Test convenzionale per attaccamento patogeno e la colonizzazione utilizzare un monostrato di cellule eucariote in piastre di coltura dei tessuti in cui vengono aggiunti gli agenti patogeni. Questi modelli non sono fisiologicamente rilevanti in quanto non contengono un commensale biofilm batterici sviluppato su cellule eucariotiche. Semplice aggiunta di un pre-cresciuta coltura batterica alle cellule eucariotiche è improbabile che possa portare a questa conformazione come biofilm sono altamente organizzate strutture che si sviluppano nel tempo, ed è estremamente difficile, se non praticamente impossibile, per le cellule eucariotiche cultura in presenza di batteri per lunghi periodi di tempo senza una significativa perdita di vitalità. Dal momento che gli agenti patogeni non navigare attraverso un biofilm commensale in questi modelli di attaccare le cellule epiteliali, questi modelli non esattamente imitare l'organizzazione delle cellule epiteliali e batteri commensali nel tratto GI. Qui, delineare lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi che utilizza a controllo pneumatico di cattura per co-coltura di cellule eucariotiche e batteri. Utilizzando cellule HeLa come la linea delle cellule eucariotiche modello e EHEC come l'agente patogeno modello, mostriamo che la co-coltura dispositivo può mantenere la regione insulare isolato così come il supporto della coltivazione e lo sviluppo di un monostrato di cellule HeLa e un commensale E. coli biofilm. La microfluidica co-coltura modello non solo consente la localizzazione dei batteri commensali e cellule epiteliali, ma anche pre-espone gli agenti patogeni di batteri commensali prima di incontrare le cellule epiteliali, quindi, presenta un ambiente fisiologicamente più rilevanti durante la colonizzazione. Inoltre, la co-coltura modello può essere un utile strumento per studi fondamentali focalizzata sullo studio del ruolo dei segnali specifici e infettività EHEC nonché per applicazioni quali lo screening potenziali ceppi probiotici.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (cbet 0.846.453) e il National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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