Summary
Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.
Abstract
El ser humano gastrointestinal (GI) es un entorno único en el que las células epiteliales intestinales y no patógenas (comensales), las bacterias conviven. Se ha propuesto que el microambiente que el patógeno se encuentra en la capa de comensales es importante para determinar la extensión de la colonización. Los métodos actuales de cultivo para la investigación de la colonización de patógenos no son muy adecuadas para la investigación de esta hipótesis, ya que no permiten el co-cultivo de bacterias y células epiteliales de una forma que imita el microambiente del tracto gastrointestinal. Aquí se describe un co-cultivo de microfluidos modelo que permite a la cultura independiente de las células eucariotas y las bacterias, y probar el efecto del microambiente comensales en la colonización de patógenos. El modelo de co-cultivo se demuestra mediante el desarrollo de un comensal
Protocol
1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía 1 (no se muestra en este video).
- El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 "maestros" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación de los diferentes componentes (PDMS de diferente grosor, el co-cultivo de la cámara) en una sala limpia. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 maestros a fluorosilane vapor en un desecador conectado a una fuente de vacío para facilitar la liberación fácil de PDMS del maestro. Añadir una gota de fluorosilane a una toalla de papel y aplicar vacío durante un minuto. Retire el vacío y dejar 30 minutos para la deposición de fluorosilane. Mantenga el SU-8 maestro en un recipiente cerrado para su uso futuro.
2. Replica moldeo de PDMS de SU-8 master 2
- La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestro.
- Mezclar el PDMS pre-polímero y la cruz enlazador en un peso de 10:01. relación y desgasificar en un desecador durante una hora (o hasta que las burbujas de aire de la mezcla de PDMS).
- Coloque el SU-8 maestro en una placa de Petri y con cuidado vierta la mezcla de PDMS en la parte superior de la SU-8 maestro. Desgasificar la PDMS nuevo.
- Girar el molde a 1200 rpm durante un minuto para conseguir un espesor uniforme PDMS de alrededor de 100μm en el molde.
- Calentar la cápsula de Petri que contiene el PDMS y el SU-8 molde maestro a 80 ° C durante una hora para curar el PDMS.
- Quite la cubierta de curado PDMS SU-8 maestros de la placa.
- Pelar el molde de PDMS del maestro SU-8.
- Perfore cuatro agujeros en el molde de PDMS con un calibre 20 de extremo romo de la aguja dos entradas de bacterias, una toma de corriente y un puerto de neumáticos.
3. La unión de varias capas dispositivos PDMS: Este dispositivo se monta con tres capas: una capa superior que contiene el canal principal, una capa de neumático medio, y una capa inferior de bacterias que contiene los canales para las bacterias. Las tres capas se montan como se describe a continuación.
- Húmedas las membranas de PDMS con metanol y con cuidado la cáscara de la SU-8 molde maestro utilizando pinzas limpias. Coloque la membrana en una hoja de teflón.
- Coloque la membrana de neumáticos y la capa de fluido en una cámara de plasma de oxígeno. A su vez en el plasma durante 40 segundos (la presión de oxígeno 10 sccm, RF 100W).
- Después de la exposición al plasma, alinee (10 minutos) de la membrana en la parte inferior del canal PDMS el uso de fórceps. Adición de metanol en la membrana y ayuda a las capas PDMS libre circulación de las capas, y hace que la alineación sea más fácil. En este caso, el dispositivo se coloca en un trozo de gasa para permitir que los vapores de metanol para escapar.
- Curar las capas alineadas PDMS sobre una placa a 80 ° C durante 8 h.
- Después de la unión de la membrana neumática en la capa inferior, repita los pasos 3,2 a 3,4 para unir el canal superior en el dispositivo montado compuesto PDMS.
4. Montaje del dispositivo de PDMS 3,4
- Taladrar agujeros en los puertos de entrada y salida utilizados para la siembra de las células eucariotas y las bacterias.
- Conecte el tubo Tygon (0,01 pulgadas OD) a los puertos y operar la capa de neumáticos tirando con una jeringa de 20 ml.
- Coloque el modelo de PDMS y un portaobjetos de vidrio pre-limpieza en una cámara de plasma de oxígeno. A su vez en el plasma durante 20 segundos (la presión de oxígeno 20 sccm, RF de 300 vatios), sin aplicar el vacío.
- Con el fin de evitar el contacto entre la isla de la pared (PDMS) de unión a la lámina de vidrio, inmediatamente conecta una jeringa en el dispositivo y aplicar vacío tirando de la jeringa y manteniéndolo en su lugar.
- Presione suavemente el modelo de PDMS sobre el vidrio (en 2 minutos).
- Cure el dispositivo PDMS a 80 ° C durante 10 minutos.
5. El tratamiento de la superficie del vidrio con la fibronectina
- Esterilizar dispositivo bajo UV durante 15 minutos después de la conexión de tubos Tygon para cada puerto.
- Llena y el flujo de la esterilización en el canal PBS para eliminar los desechos en el canal. Aplicar el flujo de 10 minutos para eliminar las burbujas de aire. Las burbujas de aire pueden escapar fácilmente el PDMS, debido a su permeabilidad a los gases.
- Llene una solución de tinte de color en el canal de neumáticos para evitar la formación de burbujas de aire en el canal.
- Para facilitar la siembra de células eucariotas en el cristal, introducir un 1 mg / ml de solución de fibronectina en el dispositivo y se incuba durante 40 min a 37 ° C.
- Lavar el exceso de fibronectina con 1 ml de medio de crecimiento.
6. Formación y medición de los comensales E. coli en el biofilmislas
- Diluir las bacterias comensales (por ejemplo, E. coli BW25113/pCM18) en los medios de comunicación M9 mínimo de OD 600 ~ 1 para la formación de un biofilm comensales en la puerta cerrada / islas.
- Cerca de la pared isla mediante la aplicación de presión positiva-líquido. Un casero de aire-líquido del convertidor de presión se utiliza para prevenir la formación de burbujas de aire en el canal.
- Introducir el comensal E. coli en las islas con la válvula cerrada, y permitir que las bacterias para fijar durante 1 hora a 32 ° C.
- Lavado de las bacterias sin ataduras y perfundir una suspensión diluida bacteriana (OD 600 ~ 0,05) en 0.25mL/hr durante 12 horas.
- Enjuague la biopelícula con los medios de cultivo DMEM fresco para eliminar las bacterias débilmente unidos y prepararse para la fijación de las células eucariotas.
- La imagen de la biopelícula con una Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope (Bannockburn, IL), y visualizar la arquitectura de biofilm con el software Imaris 5.
7. La siembra de las células eucariotas alrededor de las islas bacteriana 6-8
- Trypsinize células HeLa del frasco de cultivo de tejidos y resuspender en DMEM los medios de comunicación para una densidad de siembra de 5 x 10 5 células / ml.
- Introducir células HeLa en el dispositivo con un caudal de 2 ml / min usando una bomba de jeringa Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Asegúrese de que el muro de la isla es baja por lo que la biopelícula bacteriana es independiente de la región de células HeLa. Este paso se debe realizar en el escenario de un microscopio de luz para que la uniformidad de la siembra se puede determinar.
- Abrazadera de la toma de células para reducir el movimiento de la suspensión de células en el canal y se incuba durante 6 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora.
- Perfundir el dispositivo con el medio de crecimiento a 0,5 mL / h para eliminar las células sueltas.
- Actualizar los medios de comunicación DMEM de HeLa y E. comensales coli, cada 6 horas.
8. Introducción de bacterias patógenas en la isla y la exposición a las células eucariotas
- Prepare E. coli O157: H7 (ECEH) para infectar las células HeLa a una multiplicidad de infección (MOI) de 100:1 200:1 (número de células HeLa por ECEH).
- Enjuagar y lavar las bacterias comensales débilmente unidos.
- Introducir una suspensión diluida EHEC (OD 600 ~ 0,1) en las islas.
- Incubar dispositivo a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora durante 6 horas sin flujo para permitir que ECEH de estar expuestos a las señales presentes en el biofilm comensales.
- Levantar el muro de PDMS para exponer por ECEH en las islas comensales a las células HeLa durante 6 horas.
- Enjuague el canal PBS y la mancha de células vivas y muertas utilizando el kit de Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA).
- Lugares de múltiples imágenes en un microscopio Zeiss Axiovert 200M fluorescencia y estimar el número de células vivas y muertas.
9. Los resultados representativos 9
La secuencia de eventos en las infecciones del tracto GI fue imitado por el desarrollo de una monocapa de células HeLa y E. comensales coli biofilm y la exposición de ECEH de la biopelícula comensales antes de la infección de células HeLa. Los pasos involucrados en la fabricación de la co-cultivo de microfluidos del modelo se muestra en la Figura 1. Figura 2A muestra una representación en 3 dimensiones del dispositivo de co-cultivo. Las dos regiones en el dispositivo de co-cultivo de la cámara de cultivo de células eucariotas y la isla de bacterias se muestran en la Figura 2B con tintes de diferentes colores (morado para las regiones eucariotas y verde para la isla de bacterias). La posibilidad de aislar a las regiones de cultivo bacteriano de la región circundante eucariotas se muestra en la Figura 2C el uso de tintes de color. Figura 3 muestra los resultados representante de co-cultivo de células epiteliales y bacterias. Figura 3A muestra la colonización del biofilm comensales (verde) por la isla ECEH (rojo). Figura 3B muestra la yuxtaposición de las células epiteliales y E. comensales coli con ECEH en la isla de bacterias. El PP expresa ECEH y las buenas prácticas agrarias expresar las bacterias comensales se localizan en la isla cuando la pared PDMS se reduce, lo que demuestra la viabilidad de aislar a la isla de bacterias de las células epiteliales.
Figura 1: Esquema de la siembra celular en el modelo de co-cultivo. (1) El muro de PDMS se reduce para formar una isla, las bacterias comensales son introducidos en la isla, y fibronectina se corría alrededor de la isla. (2) células HeLa se siembran en las regiones que rodean la isla. (3) Después de llegar a las células HeLa confluencia y el biofilm comensales ha desarrollado, ECEH se introduce en la isla. (4) El muro de PDMS se levantapara exponer las células HeLa que rodean la isla de ECEH. El recuadro muestra los detalles de la operación de la válvula.
Figura 2: Modelo de microfluidos para el co-cultivo de células epiteliales y bacterias. (A) en tres dimensiones versión del dispositivo de co-cultivo que muestra neumático accionado por regiones de captura para la formación de islas de las infecciones en las células epiteliales. Cada isla bacteriana (1200 m de diámetro y 1.000 m de distancia) tiene una entrada independiente y una salida para proporcionar medios de cultivo y la eliminación de los residuos de la isla. (B) Micrografía del dispositivo de co-cultivo con tintes de colores que muestra las diferentes regiones (zona de las células epiteliales, las islas de bacterias). (C) La fidelidad del sistema de recogida neumática se muestra mediante la reducción de la pared PDMS (panel izquierdo), utilizando un canal neumática activa (azul), la introducción de tinte púrpura en la cerrada islas, y colorante amarillo que fluye alrededor de ella durante 48 h. Cuando el muro se levanta PDMS (panel derecho), la región insular está expuesta al medio circundante de color amarillo. Barra de escala representa a 500 micras.
Figura 3: Co-cultivo de células HeLa y bacterias. (A) Imagen de fluorescencia de RFP-expresando ECEH y que expresan GFP E. coli BW25113 en la isla. (B) Superposición de transmisión, verde y rojo, imágenes de fluorescencia en el dispositivo. Barra de escala representa a 200 micras.
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Discussion
Ensayos convencionales para la fijación y la colonización de patógenos utilizar una monocapa de células eucariotas en placas de cultivo de tejido en el que los agentes patógenos se agregan. Estos modelos no son fisiológicamente relevantes, ya que no incorporan un biofilm de bacterias comensales desarrollado en las células eucariotas. Simple adición de un cultivo de bacterias pre-convertido en células eucariotas es improbable que lleve a esta conformación, como los biofilms son muy organizadas las estructuras que se desarrollan con el tiempo, y es extremadamente difícil, si no casi imposible, para cultivar células eucariotas en la presencia de bacterias durante largos períodos de tiempo sin pérdida significativa de la viabilidad. Dado que los patógenos no navegar a través de un biofilm comensales en estos modelos para adherirse a las células epiteliales, estos modelos no reproducir fielmente la organización de las células epiteliales y bacterias comensales en el tracto gastrointestinal. Aquí, se describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos que utiliza neumática controlada captura para el co-cultivo de las células eucariotas y las bacterias. El uso de células HeLa como la línea de modelo de la célula eucariota y EHEC como el patógeno modelo, se muestra que el dispositivo de co-cultivo se puede mantener a la región aislada isla, así como apoyar el cultivo y desarrollo de una monocapa de células HeLa y E. comensales coli biofilm. El co-cultivo de microfluidos modelo no sólo permite la localización de las bacterias comensales y las células epiteliales, sino también pre-expone a los patógenos a las bacterias comensales antes de encontrarse con las células epiteliales, por lo tanto, presentar un ambiente fisiológicamente más relevantes durante la colonización. Además, el modelo de co-cultivo pueden ser una herramienta útil para los estudios fundamentales se centraron en investigar el papel de las señales específicas sobre la infectividad de ECEH, así como para aplicaciones tales como detección potencial de cepas probióticas.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453) y los Institutos Nacionales de Salud (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
