Summary
Detta protokoll beskriver en mikroflödessystem co-kultur-modellen för samtidig och lokal kultur av epitelceller och bakterier. Denna modell kan användas för att undersöka betydelsen av olika lösliga molekylära signaler på patogenes samt skärm effektiviteten av förmodade probiotiska bakteriestammar.
Abstract
Den mänskliga gastrointestinala (GI) tarmkanalen är en unik miljö där tarmens epitelceller och icke-patogena (kommensala) bakterier samexistera. Det har föreslagits att mikromiljön att patogenen möten i kommensala skiktet är viktigt för att bestämma omfattningen av koloniseringen. Aktuell kultur metoder för att undersöka patogen kolonisation är inte väl lämpade för att undersöka denna hypotes eftersom de inte möjliggöra sam-kultur av bakterier och epitelceller på ett sätt som efterliknar mag-tarmkanalen mikromiljö. Här beskriver vi en mikroflödessystem co-kultur-modell som möjliggör oberoende kultur av eukaryota celler och bakterier, och testa effekten av kommensala mikromiljön på patogen kolonisering. Samarbetet kulturen modell bevisas av att utveckla en commensal
Protocol
1. Tillverkning av kisel mästare med standard SU-8 fotolitografi 1 (visas inte i denna video).
- Använd standard SU-8 fotolitografiska metoder för att skapa en SU-8 "mästare" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) för att tillverka de olika komponenterna (PDMS membran av olika tjocklek, co-kultur avdelningen) i ett renrum. Sådan herre formar kan tillverkas i alla mikrofabrikation anläggning (t ex Stanford Mikrofluidik Foundry, http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Före PDMS replikering, utsätta SU-8 mästare till fluorosilane ånga i en exsickator bifogas ett vakuum källa för att underlätta enkel frisättning av PDMS från master. Tillsätt en droppe fluorosilane till en pappershandduk och ansöka vakuum för en min. Ta bort vakuum och tillåter 30 min för deponering av fluorosilane. Håll SU-8 mästare i en sluten behållare för framtida bruk.
2. Replika gjutning av PDMS från SU-8 Master 2
- Den fluidic lager och kontroll lagret görs av replica gjutning av PDMS från SU-8 master.
- Blanda PDMS pre-polymer och cross-länkare på 10:01 WT. förhållandet och lufta i en torkapparat för 1 timme (eller tills luftbubblor avlägsnas från PDMS blandning).
- Placera SU-8 mästare i en petriskål och försiktigt häll PDMS blandningen ovanpå SU-8 master. Lufta den PDMS igen.
- Snurra formen vid 1200 rpm i en minut för att få en enhetlig PDMS tjocklek på ca 100μm i formen.
- Värm upp petriskål innehåller PDMS och SU-8 mästare mögel vid 80 ° C i en timme för att bota PDMS.
- Ta bort härdat PDMS-täckt SU-8 mästare från kokplattan.
- Skala PDMS mögel från SU-8 master.
- Borra fyra hål i PDMS formen med en 20 gauge trubbig slut nål för två bakterier inlopp, ett utlopp och en pneumatisk port.
3. Limning av Multilayer PDMS enheter: Denna anordning monteras med tre lager-ett ytskikt som innehåller den huvudsakliga kanalen, en mitt pneumatisk lager, och en undre bakteriell lager som innehåller kanaler för bakterier. De tre lagren är monterade som beskrivs nedan.
- Blöt PDMS membran med metanol och försiktigt skala dem från deras SU-8 mästare mögel med en ren pincett. Placera membranet på en teflon ark.
- Placera pneumatiska membranet och fluidic lager på en syre plasma kammare. Slå på plasma under 40 sekunder (syretrycket 10 SCCM, RF-styrka 100W).
- Efter exponering för plasma, anpassa (inom 10 minuter) membranet i botten PDMS kanalen med hjälp av pincett. Lägga metanol på membranet och PDMS lagren hjälper fria rörligheten för lagren, och gör anpassningen lättare. I det här fallet är enheten placeras på en bit gasbinda så att metanol ångorna att fly.
- Bota de anpassade PDMS lagren på en värmeplatta vid 80 ° C i 8 h.
- Efter limning den pneumatiska membranet på bottenlagret, upprepa steg från 3,2 till 3,4 för att binda upp kanalen på de församlade komposit PDMS enhet.
4. Montering av PDMS-enheten 3,4
- Borra hål i inlopp och utlopp portar som används för sådd eukaryota celler och bakterier.
- Anslut Tygon slang (0,01 tums OD) till portarna och driva pneumatiska lagret genom att dra med en 20 ml spruta.
- Placera PDMS-modellen och en förrengöras glasskiva i en syre plasma kammare. Slå på plasma för 20 sek (syretrycket 20 SCCM, RF-effekten 300W) utan att använda vakuum.
- För att förhindra kontakt mellan ön väggen (PDMS) bindning till glasskiva, omedelbart ansluta en spruta till enheten och tillämpa vakuum genom att dra i sprutan och håller den på plats.
- Tryck försiktigt PDMS-modellen på glaset (inom 2 minuter).
- Bota PDMS-enheten vid 80 ° C i 10 minuter.
5. Att behandla glasytan med fibronektin
- Sterilisera enhet under UV i 15 minuter efter att du anslutit Tygon slang till varje port.
- Fyll och flöde i steriliserade PBS i kanalen för att ta bort eventuellt skräp i kanalen. Ansök flöde i 10 minuter för att avlägsna luftbubblor. Luftbubblorna kan enkelt undgå PDMS på grund av sin gas permeabilitet.
- Fyll en lösning färg färgämne i pneumatiska kanalen för att förhindra att luftbubblor bildas i kanalen.
- För att underlätta eukaryota celler sådd på glaset, införa ett 1 mikrogram / ml lösning av fibronektin i enheten och inkubera i 40 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta överskottet fibronektin med 1 ml tillväxt medier.
6. Bildning och mätning av commensal E. coli biofilm iöar
- Späd ut bakteriefloran (t.ex. E. coli BW25113/pCM18) i M9 minimal media till OD 600 ~ 1 för att bilda en kommensala biofilm i den slutna kammare / öar.
- Stäng ön väggen genom att tillämpa positiv vätske-tryck. En hemgjord luft-vätska trycket omvandlare används för att förhindra bildning luftbubbla i kanalen.
- Introducera commensal E. coli till öarna med ventilen stängd och låta bakterier att fästa i 1 timme vid 32 ° C.
- Tvätta den fria bakterier och BEGJUTA en utspädd bakteriesuspensionen (OD 600 ~ 0,05) vid 0.25mL/hr under 12 timmar.
- Skölj biofilmen med färska DMEM tillväxt media att ta bort löst knutna bakterier och förbereda sig för eukaryota celler fastsättning.
- Bild biofilmen med hjälp av en Leica TCS SP5 Confocal laserscanning mikroskop (Bannockburn, IL), och visualisera biofilmen arkitektur med IMARIS programvaran 5.
7. Seedning eukaryota celler runt bakteriell öarna 6-8
- Trypsinize HeLa celler från vävnadskultur kolv och återsuspendera i DMEM media för en seedning densitet på 5 x 10 5 celler / ml.
- Introducera HeLa celler i enheten vid ett flöde på 2 ml / min med hjälp av en Picoplus sprutpump (Harvard Apparattus, MA). Se till att ön väggen sänks så att den bakteriella biofilmen är skild från HeLa cellen regionen. Detta steg bör utföras på scenen av ett ljusmikroskop så att enhetligheten i sådd kan fastställas.
- Kläm cellen utlopp för att minska rörelsen av cellsuspensionen i kanalen och inkubera i 6 timmar vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- BEGJUTA enheten med odlingsmedium vid 0,5 ml / tim för att ta bort lös celler.
- Uppdatera DMEM media för HeLa och commensal E. coli var 6 timmar.
8. Införande av patogena bakterier i ön och exponering för eukaryota celler
- Förbered E. coli O157: H7 (EHEC) att infektera HeLa celler med en mångfald av infektion (moi) på 100:1 200:1 (antal EHEC per HeLa cell).
- Skölj och tvätta ur löst bifogade bakteriefloran.
- Inför en utspädd EHEC suspension (OD 600 ~ 0,1) till öarna.
- Inkubera enhet vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator för 6 timmar utan flöde så att EHEC att utsättas för signaler finns i kommensala biofilmen.
- Lyft PDMS väggen för att exponera EHEC i kommensala öarna HeLa celler för 6 timmar.
- Skölj kanal med PBS och bets för levande och döda celler med hjälp av Live / Dead kit (L3224, Invitrogen, CA).
- Bilden flera platser på ett Zeiss Axiovert 200M fluorescensmikroskop och uppskatta antalet levande och döda celler.
9. Representativa resultat 9
Händelseförloppet i mag-tarmkanalen infektioner var härmade genom att utveckla ett monolager av HeLa celler och en commensal E. coli biofilm och utsätta EHEC till kommensala biofilm innan infektion av HeLa celler. De olika stegen i tillverkningen av mikroflödessystem co-kultur-modellen visas i figur 1. Figur 2a visar en 3-dimensionell avbild av co-kultur-enhet. De två regioner i co-kultur enheten eukaryota cellodling kammaren och bakteriella ön visas i Figur 2B med olika färg färgämnen (lila för eukaryota regioner och grönt för den bakteriella ön). Möjligheten att isolera bakterieodling regioner från den omgivande eukaryota regionen visas i figur 2C använda färg färgämnen. Visar representativa resultat från co-kultur av epitelceller och bakterier figur 3. Figur 3A visar koloniseringen av kommensala biofilm (grön) ön med EHEC (röd). Figur 3B visar sammanställning av epitelceller och commensal E. coli med EHEC i det bakteriella ön. RFP uttrycka EHEC och GFP uttrycka bakteriefloran är lokaliserade på ön när PDMS väggen sänks, illustrerar möjligheterna att isolera bakterier ön från epitelceller.
Figur 1: Cell seeding system i samarbetet kultur-modellen. (1) De PDMS väggen sänks för att bilda en ö, är bakteriefloran förs in i ön, och fibronektin är flödade runt ön. (2) HeLa celler är seedade i de regioner som omger ön. (3) Efter HeLa celler når sammanflödet och kommensala biofilmen har utvecklats, är EHEC införs i ön. (4) De PDMS väggen lyftsupp för att exponera HeLa celler som omger ön till EHEC. Infällda bilden visar detaljer om ventilfunktion.
Figur 2: Mikroflödessystem modell för samarbete kultur av epitelceller och bakterier. (A) Tredimensionell återgivande av co-kultur-enhet visar pneumatiskt manövrerad fånga regioner för att bilda bakteriell öar bland epitelceller. Varje bakterie-ö (1200 ìm diameter och 1000 ìm mellanrum) har en separat in-och utlopp för att ge tillväxt medier och avlopp från ön. (B) mikroskop av samarbetet kultur-enhet med färg färgämnen som visar de olika regionerna (epitelceller zon, bakteriell öar). (C) trohet av pneumatiska fångst systemet visas genom att sänka PDMS väggen (till vänster) med hjälp av en pneumatiskt aktiverad kanal (blå), införande av lila färg i den slutna ö öar och flyter gul färg runt den i 48 h. När PDMS muren höjs (högra panelen), är ön regionen utsätts för den omgivande gula färg. Skala stapel representerar 500 ìm.
Figur 3: Samtidig kultur HeLa celler och bakterier. (A) Fluorescens bild av RFP-uttryckande EHEC och GFP-uttryckande E. coli BW25113 i ön. (B) Overlay överförd, grön och röd fluorescens bilder i enheten. Skala stapel representerar 200 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionella analyser för patogen kvarstad och kolonisering använda ett monolager av eukaryota celler i form av plattor vävnadsodling där patogener läggs till. Dessa modeller är inte fysiologiskt relevanta eftersom de inte innehåller en kommensala bakteriell biofilm utvecklas på eukaryota celler. Enkel tillägg av en pre-vuxen bakteriekultur att eukaryota celler är osannolik att leda till denna struktur som biofilmer är mycket välorganiserade strukturer som utvecklas över tiden, och det är oerhört svårt, om inte omöjligt, att kulturen eukaryota celler i närvaro av bakterier under längre perioder utan att förlora i bärkraft. Eftersom patogener inte navigera genom en kommensala biofilm i dessa modeller att ansluta till epitelceller, gör dessa modeller inte exakt efterlikna organiseringen av epitelceller och bakteriefloran i mag-tarmkanalen. Vi presenterar här utvecklingen av en mikroflödessystem enhet som använder pneumatiskt styrda svällning för samarbetet kultur av eukaryota celler och bakterier. Använda HeLa celler som modell eukaryota cellinje och EHEC som modell patogener, visar vi att det samarbete kulturen enhet kan hålla öregionen isolerade samt stödja odling och utveckling av en HeLa cell cellslager och en commensal E. coli biofilm. Den mikroflödessystem co-kultur-modellen inte bara möjligt lokalisering av bakteriefloran och epitelceller, men också pre-exponerar patogener att bakteriefloran före möta epitelceller, därmed presentera en mer fysiologiskt relevant miljö under kolonisationen. Dessutom kan samtidig kultur-modellen vara ett användbart verktyg för grundläggande studier som är inriktade på att undersöka betydelsen av specifika signaler på EHEC-smitta samt för applikationer såsom screening potentiella probiotiska stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation (CBET 0.846.453) och National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
